馮 偉 王 濤 董田田 徐鵬程 李克強 張?zhí)礴?王 韌 陳正行

(1. 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

重金屬鎘攝入對人身體健康有很大危害[1]。在中國南方很多區(qū)域的耕地受到重金屬鎘污染[2-3]，而與其他谷物相比，大米更容易從土壤中吸附鎘[4]，已經(jīng)成為當?shù)鼐用裆眢w中鎘最主要的來源[5]。

大米中鎘主要是和蛋白質(zhì)相結合[6-7]?，F(xiàn)有研究[8-10]對大米中鎘結合蛋白的分布、存在形式做了探索，也有報道通過物理碾磨[11]、浸泡[12]、微生物發(fā)酵[13-14]可以部分脫除大米中鎘。但目前還沒有對大米蛋白與鎘結合特性的研究報道，因而缺乏對稻米制品加工過程中脫除鎘的指導依據(jù)。

利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank，PDB)分析發(fā)現(xiàn)，在生物系統(tǒng)中各種氨基酸殘基參與金屬離子配位的頻率最高的是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的羧基，組氨酸(His)的咪唑基團以及半胱氨酸(Cys)的巰基[15-16]。大米蛋白中富含谷氨酸、天冬氨酸，也含有少量半胱氨酸和組氨酸[17]，有大量的金屬離子結合位點，而且蛋白質(zhì)分子具有復雜的空間結構，可以形成多種形式的多齒配體組合，從而強化與金屬離子形成配合物的穩(wěn)定性[18]。

大米蛋白從組成上可以分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[19-20]，依據(jù)提取方式的不同，又可分為堿法提取米蛋白(ARPS)和淀粉酶法提取米蛋白(ERPS)[21-22]。清蛋白主要分布在米糠中，且水溶性好，比較容易脫除。目前市售的食品級大米蛋白都是源自工業(yè)上以碎米為原料生產(chǎn)淀粉糖或發(fā)酵制品時獲得的酶提米蛋白。

本試驗擬以大米中提取的球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和ERPS為研究對象，分析時間、溫度、鎘濃度對蛋白與鎘結合的影響，并通過動力學模型和等溫吸附模型的建立，進一步探討不同米蛋白組分與鎘結合的機制以及與其氨基酸組成的關系，以期為米制品加工過程中鎘的脫除提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

早秈稻谷：湘早秈24號，湖南聚寶金昊農(nóng)業(yè)高科有限公司；

α-淀粉酶(Termamyl 120L)：100 000 U/mL，諾維信公司；

氯化鎘、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器和設備

礱谷機：Satake-THU 35G型，日本佐竹公司；

碾米機：Satake-TM 05G型，日本佐竹公司；

沖擊磨：XFB-500型，中國中湘制藥機械廠；

水浴振蕩床：BS-21型，南京榮華科學器材有限公司；

凍干機：Beta2-8plus型，德國Christ公司；

高速離心機：Beckman Coulter Avanti J-26 XP型，美國貝克曼庫爾特公司；

微波消解儀：WX-6000型，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；

原子吸收光譜儀：Aanalyst 600型，珀金埃爾默儀器有限公司；

掃描電鏡：TM-3030型，日本Hitachi公司；

超純水系統(tǒng)：Millipore-Q型，≥18 MΩ/cm，美國Millipore公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8800型，日本Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米粉制備 稻谷采用礱谷機脫去穎殼獲得糙米，然后采用碾米機進行碾米脫除10%米糠，獲得的大米經(jīng)粉碎并過80目篩，制得大米粉。

1.3.2 ERPS的制備 參照Morita等[23]的方法并加以改良，以上述大米粉為原料，調(diào)整米漿濃度為30 g/100 g，pH 6.0，加入0.05 g/100 g的高溫α-淀粉酶，97 ℃水浴攪拌反應90 min，反應結束后，真空抽濾，濾餅用3倍的沸水調(diào)漿，pH調(diào)至7.0，通過膠磨粉碎后，再次進行真空抽濾，最終濾餅在50 ℃烘箱烘干后，粉碎過80目篩，得到ERPS。

1.3.3 不同米蛋白組分的制備 參考改良Osborn連續(xù)提取法[24]，稱取100 g大米粉用500 mL石油醚浸泡，攪拌3 h后，在4 000 r/min離心10 min，棄去上層有機相，在通風廚內(nèi)通風揮發(fā)24 h，得到脫脂米粉樣品。在室溫條件下將脫脂米粉分別按照1∶8 (g/mL)比例，用超純水、2 g/100 mL NaCl、70%乙醇(體積比)溶液、0.1 mol/L NaOH連續(xù)提取，每次提取時間為4 h，提取后采用4 000 r/min離心10 min，所獲得鹽提上清液、堿提上清液，分別用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至等電點沉淀蛋白，醇提液用氮吹儀吹干，將所提取的蛋白，再次用去離子水洗滌后，冷凍干燥即可得到球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。將谷蛋白按照1∶8 (g/mL)的比例分散在去離子水中，加熱煮沸15 min后，再離心分離，沉淀物凍干后，即為熱變性的谷蛋白。

1.3.4 米蛋白與鎘的結合反應 精確稱取0.06 g不同的米蛋白，分別置于一系列50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL的Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液，超聲振蕩2 min后，加入一定體積的已知濃度的CdCl2溶液，再用上述Tris-HCl緩沖溶液補充至20 mL。蓋緊蓋子后，置于設定好溫度的恒溫水浴振蕩器中，以180 r/min速度振蕩一定時間，反應結束后，立即在8 000 r/min離心2 min，上清液用定量濾紙過濾后，采用原子吸收法測定其鎘濃度。

米蛋白的鎘結合量按式(1)計算：

(1)

式中：

q——米蛋白的鎘結合量,mg/g;

c0——溶液中鎘的初始濃度，mg/L；

c1——反應后溶液中鎘的濃度，mg/L；

m——米蛋白質(zhì)量，g；

v——溶液體積，L。

1.3.5 米蛋白與鎘的結合動力學、等溫吸附模型建立

(1) 動力學模型建立：參照1.3.3的反應方法，設定初始鎘濃度為100 mg/L，反應溫度為303 K，反應時間分別選取1，3，5，10，30，60，120 min，測定反應后溶液中鎘的濃度，并采用目前廣泛使用的3種模型，分別為準一級動力學模型、準二級動力學模型和Elovich模型[25]，研究吸附時間與單位吸附量的關系，建立吸附動力學模型，得到吸附速率和吸附機制。

準一級動力學模型：

qt=qe[1-exp(-k1t)]，

(2)

式中：

qe——平衡吸附量，mg/g；

k1——準一級動力學模型速率常數(shù)，min-1；

t——吸附時間，min。

準二級動力學模型：

(3)

式中：

k2——準二級動力學模型速率常數(shù)，g/(mg·min)。

t=0時吸附速率h可以通過式(4)進行計算[26]：

(4)

Elovich模型：

qt=a+bln(t)，

(5)

式中：

a、b——反應常數(shù)。

(2) 等溫吸附模型的建立：參照1.3.3的反應方法，設定不同初始鎘濃度為10，20，40，60，80，100 mg/L，在288，303，318 K條件下，分別測試4種米蛋白與鎘的結合能力，繪制吸附等溫曲線，并采用Langmuir(L)模型和Freundlich(F)模型進行擬合[27]，其方程式如下：

(6)

(7)

式中：

qe——平衡吸附量，mg/g；

qmax——吸附劑的飽和吸附量，mg/g；

ce——平衡濃度，mg/L；

KL——L模型的吸附平衡常數(shù)，與吸附劑和吸附質(zhì)的結合強度有關；

KF——F模型的吸附平衡常數(shù)，KF越大，吸附能力越強；

n——與吸附強度有關的F模型常數(shù)。

(3) 熱力學參數(shù)確定：參考?zcan等[28]的方法，吸附過程的熱力學參數(shù)吉布斯自由能可以通過式(8)計算得到。

ΔG°=-RTlnKL，

(8)

式中：

ΔG°——吉布斯自由能，kJ/mol；

R——氣體通用常數(shù)，8.314 J/mol；

T——絕對溫度，K。

焓變ΔH°(kJ/mol)和熵變ΔS°(J/mol)則可以通過式(9) 求出：

(9)

以lnKL和1/T作圖可獲得一條直線，再通過該直線的斜率和截距分別計算出ΔH°和ΔS°。

1.3.6 鎘濃度的測定 參照GB 5009.15—2014，設定儀器的波長為228.8 nm、電流為4 mA、狹縫為0.5 nm，調(diào)整背景為塞曼效應。試樣的預處理采用微波消解法。

1.3.7 理化指標測定

(1) 蛋白質(zhì)含量：按GB 5009.5—2016中凱氏定氮法執(zhí)行。

(2) 水分含量：按GB 5009.3—2016中直接干燥法執(zhí)行。

1.3.8 掃描電鏡分析(SEM) 取些許樣品置于導電膠表面，對樣品進行噴金處理。采用掃描電鏡在10 kV下觀察粉末狀樣品的微觀結構。

1.3.9 氨基酸分析 采用氨基酸分析儀測定不同種類氨基酸組分的含量，蛋白樣品測定前須用6 mol/L HCl于充氮管中充分酸水解(110 ℃，24 h)，具體方法參考GB/T 5009.124—2003。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均值標準差(X±SD)表示，用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖，并用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVE方差分析及相關性分析。

2 結果與討論

2.1 不同米蛋白樣品的蛋白含量

由表1可見，原料大米粉中的蛋白含量只有8.53%，幾種蛋白經(jīng)過提純后蛋白含量都達到了80%以上，谷蛋白的蛋白含量最高(86.26%)，ERPS蛋白含量最低(82.12%)，球蛋白、醇溶蛋白分別達到了84.38%和85.54%。EPRS蛋白濃度最低，主要是蛋白提取方式造成的，因為酶法工藝是將淀粉水解，蛋白高溫變性后，將蛋白過濾分離所得，基本上所有米蛋白組分都在沉淀物中，同時脂肪、纖維等非水溶性的物質(zhì)也都留在蛋白中，所以得率高，但純度相對較低。

表1 不同米蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量

2.2 不同米蛋白組分與鎘結合的吸附動力學

圖1給出了米蛋白吸附鎘的q值與反應時間的關系，可以看出幾種米蛋白與鎘的結合速度都非常快，ERPS、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白在反應5 min時，q值就分別達到了8.84，2.15，16.86，8.46 mg/g，在30 min時則分別增加到了9.87，3.64，23.78，9.40 mg/g，超過30 min，q值變化就非常小了，標志著反應達到了平衡。反應平衡后，醇溶蛋白的q值最高，其次是谷蛋白，最后是球蛋白。ERPS、谷蛋白、熱處理谷蛋白三者的q值基本一致，主要是因為ERPS中80%以上都是谷蛋白，同時也說明了熱處理對蛋白與鎘的結合基本沒有產(chǎn)生影響，Morita等[23]也發(fā)現(xiàn)加熱處理并未使米蛋白形成更大的聚合體，因此氨基酸組成和一級結構可能是決定米蛋白與鎘結合關鍵因素。

圖1 反應時間對米蛋白與鎘結合的影響

如圖2所示，2種蛋白表面均呈片狀，且內(nèi)部結構非常致密，相似的結果之前已被報道[29-30]。由于ERPS和谷蛋白幾乎無法溶解(≤0.8 g/100 mL)，掃描電鏡結果基本上反映了二者懸浮在水中的形態(tài)特征。ERPS和谷蛋白的形態(tài)學特征，決定了與鎘的結合主要發(fā)生在與水接觸的蛋白表面，而蛋白熱變性聚集更多是疏水基團之間相互作用，因此可以解釋熱處理對鎘結合基本沒有產(chǎn)生影響。由于反應發(fā)生在蛋白表面，這也解釋了ERPS、谷蛋白與鎘的結合都非常迅速的原因，球蛋白、醇溶蛋白同樣不溶于水，所以有相類似的反應速率。Liu等[31]研究了大豆蛋白微球與鎘的結合行為，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白微球的多孔表面結構需要鎘向內(nèi)進行擴散滲透，所以直至240 min后反應才達到平衡。此外，大豆蛋白微球?qū)︽k的結合量(83.36 mg/g)明顯高于大米蛋白，可能是大豆蛋白微球的中空結構創(chuàng)造了更多的鎘結合位點。

準一級動力學模型假設吸附速率正比于有效吸附位點數(shù)，即物理吸附過程；準二級動力學模型假設吸附過程是由于吸附劑與吸附質(zhì)間通過共用電子或者交換電子完成的，即化學吸附過程；Elovich模型綜合了準一級與準二級動力學模型的邊界條件范圍，即同時存在物理吸附與化學吸附[26]。表2給出了不同米蛋白與鎘結合的動力學擬合結果，通過相關系數(shù)R2可以看出Elovich模型的擬合效果不好，而準二級動力學模型的R2要優(yōu)于準一級動力學模型，故準二級動力學模型更適合用于描述不同米蛋白與鎘的結合過程，因此推測該結合過程應該是以化學吸附為主。

圖2 谷蛋白和ERPS的掃描電鏡圖

表2 不同米蛋白與鎘結合的動力學模型參數(shù)

2.3 不同米蛋白組分與鎘結合的吸附等溫線

由圖3可見，隨著溫度升高，4種米蛋白的鎘結合量q值都有一定程度增加，與Liu等[31]在研究大豆中空微孔蛋白在水溶液中吸附金屬離子時所得結果一致。溫度升高，一方面可以使蛋白分子展開，暴露出更多與鎘結合的位點，另一方面可能反應是吸熱反應，溫度上升提高了米蛋白與鎘結合反應的平衡常數(shù)。

初始鎘濃度也是影響米蛋白與鎘結合的關鍵因素。在圖3中，隨著鎘濃度增加，ERPS、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的q值均顯著增加，當初始鎘濃度分別達到60，40，80，60 mg/L 后，q值的增加幅度開始減緩，而溶液中鎘離子平衡濃度開始快速上升，表明在反應開始時，各蛋白組分表面都有大量的結合位點，可以與鎘進行結合，因此在低鎘濃度水平上，鎘的初始濃度在結合能力中扮演了重要的角色[32]，隨著鎘初始濃度的增加，蛋白的結合位點逐漸減少。與此同時，因為結合位點上的離子密度增加，鎘離子之間的自我排斥也相應增加，因此抵制游離鎘的進一步與蛋白對接，所以當鎘的初始濃度大于一定值時，蛋白上的結合位點接近飽和，溶液中鎘的平衡濃度急劇增加。

表3是用Langmuir和Freundlich吸附等溫模型對試驗數(shù)據(jù)進行擬合的結果。由表3可知：在3個溫度條件下，4種米蛋白的L模型的回歸相關系數(shù)(R2)為0.942～0.999，要顯著優(yōu)于F模型(0.833～0.989)，表明L模型更適合用于描述米蛋白與鎘的結合過程。Saif等[33]在研究中也發(fā)現(xiàn)，L模型能夠很好地描述鎘與馬錢子(strychnospotatorum)種子中蛋白質(zhì)的結合。L模型假設吸附質(zhì)只在吸附劑表面進行單層吸附，被吸附在吸附劑表面的吸附質(zhì)間沒有相互作用；而F模型則假設吸附過程沒有限定，吸附過程傾向于多層吸附[34-35]。這也說明了米蛋白與鎘的結合應該是在表面進行的單層吸附，同時進一步解釋了米蛋白與鎘的結合速度非?？斓脑?。

本研究中通過L模型獲得的最大吸附量qmax值均比實際測得數(shù)值要高，這可能是試驗濃度范圍較小(10～100 mg/L)，而L模型適用于較大的濃度范圍[36]。與試驗結果不同的是，4種蛋白在L模型中得到的qmax值均隨著溫度升高而呈下降趨勢。Boparai等[37]研究了鐵納米粒子對鎘的吸附，發(fā)現(xiàn)297 K時qmax值為769.2 mg/g，在307 K時則降為714.3 mg/g，出現(xiàn)了與本研究類似的情況。

圖3 不同米蛋白與鎘結合的等溫吸附曲線

表3 不同米蛋白與鎘結合的等溫吸附模型及熱力學參數(shù)

在F模型中KF可以大致表示吸附能力的強弱，KF值大則表示吸附能力強，n-1值也可作為吸附劑對重金屬離子吸附作用的親和力指標，n-1值愈小，表示吸附劑對重金屬離子的親和力愈大[38]。在本研究中4種蛋白都遵循了隨著溫度升高KF值增大，n-1值減小的規(guī)律，與試驗結果一致，這也說明溫度升高可以提高大米蛋白對鎘的吸附能力和親和力。

2.4 不同米蛋白組分與鎘結合的吸附熱力學分析

在L模型成功擬合的基礎上，利用熱力學方法確定了4種米蛋白與鎘結合的熱力學參數(shù)，如表3所示。在該研究所選取的3個不同溫度條件下，4種米蛋白與鎘結合的ΔG°值均為負值，表明4種米蛋白與鎘的結合都是自發(fā)的。此外，4種蛋白與鎘結合的ΔH°都是正值，說明該反應是吸熱反應，這與試驗實測結果相一致，并證實了前文中關于溫度升高導致結合反應的平衡常數(shù)增大的假設。

不同作用力在吸附中所需要的熱不同，范德華力的吸附熱為4～10 kJ/mol，疏水鍵力約為5 kJ/mol，氫鍵力為20～40 kJ/mol，配位基交換約為40 kJ/mol，偶極間力為2～29 kJ/mol，化學鍵力>60 kJ/mol[39]。ERPS、谷蛋白與鎘結合反應的ΔH°分別為41.44，40.32 kJ/mol，均大于配位基交換熱(大約40 kJ/mol)，醇溶蛋白與鎘結合反應的ΔH°甚至達到了58.75 kJ/mol，接近于化學健力。因此，推測鎘與ERPS、谷蛋白、醇溶蛋白的結合是配位結合，其中與醇溶蛋白的配位結合可能是一種多齒配位的形態(tài)。

2.5 不同米蛋白組分的氨基酸組成與鎘結合量的相關性分析

由表4可知：醇溶蛋白中Glu含量最高，達到了27.13%，His和Cys含量均為幾種蛋白中最低，分別只有1.40%和0.47%，這與前人[40-41]的研究結果相吻合；球蛋白中Cys含量最高，達到了1.29%，但醇溶蛋白與鎘的結合能力要遠高于球蛋白。以表3中ERPS、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白在303 K等溫吸附中實測的qmax值，與不同蛋白的氨基酸組成，進行相關性分析，q值與Glu含量的相關性達到了0.948，與Glu和Asp含量之和的相關性達到了0.967。之所以產(chǎn)生上述現(xiàn)象，可能是Cys、His、Asp、Glu在蛋白質(zhì)中絕大部分都存在于肽鏈中，因此能與鎘結合的主要是側鏈基團，這4種氨基酸的pkaR值分別為8.80，7.00，4.60，4.60[42]，而米蛋白的正常pH值為6～7，此時絕大部分的Asp和Glu都帶有負電荷，供電子能力更強，更適合與鎘進行結合。

表4 不同米蛋白組分的氨基酸組成及其與鎘結合量的相關性分析

3 結論

本試驗研究了4種不同米蛋白樣品與鎘的結合規(guī)律，結果表明：米蛋白致密的片狀結構導致其與鎘的結合是快速的、發(fā)生在蛋白表面的；該結合是自發(fā)的、吸熱的且以單分子層的化學吸附為主；在4種米蛋白中，醇溶蛋白與鎘結合的ΔH°值最大，推測是與鎘形成了多齒配體結構；此外，米蛋白與鎘的配位結合主要是通過Asp和Glu來實現(xiàn)的?；谏鲜鼋Y果，后續(xù)的研究將從配位競爭的角度來探索其它金屬離子對米蛋白中鎘的脫除效果。