高 寧，李 梅，李亞萍，王文俊，賈曉黎，黨雙鎖

人腸道病毒71型（enterovirus 71, EV71）能引發(fā)手足口?。╤and foot and mouth disease,HFMD），以3歲以下嬰幼兒發(fā)病為主[1]。成人大多通過隱性感染獲得抗體，感染EV71后很少發(fā)病，但可成為傳染源[2]。成人HFMD發(fā)病癥狀少見或是輕微與病毒感染后免疫功能較強(qiáng)有關(guān)[3-5]。我們前期研究結(jié)果顯示EV71感染患兒的外周血T細(xì)胞存在結(jié)構(gòu)蛋白VP1和非結(jié)構(gòu)蛋白RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[6]。目前有關(guān)成人EV71特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫記憶的研究甚少。本研究通過檢測40例健康成人VP1和RdRp抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，旨在初步闡述健康成人EV71 VP1和RdRp抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的特點。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2012年8月于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢（均簽署知情同意書）的40例健康成人。其中男19例，女21例，年齡為21～65歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎功能正常，HBV、HCV血清學(xué)指標(biāo)陰性，既往無過敏史，無自身免疫性疾病、腫瘤、免疫缺陷者，未使用激素和免疫抑制劑，近2周內(nèi)無任何疾病和不適癥狀，無家族性疾病史及傳染病史。

1.2 儀器與試劑 自動多肽合成機(jī)（MBS396，Advanced Chem Tech, Louisville, KY）；超凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司）；ELISPOT 讀板儀（德國AID公司）；RPMI 1640完全培養(yǎng)液購于美國GIBCO公司；淋巴細(xì)胞分離液均購于中國天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）和胎牛血清購于美國Sigma公司；聚偏氟乙烯膜酶標(biāo)板購于法國Millipore公司；IFN-γ 酶聯(lián)免疫斑點分析法（IFN-γ enzyme-linked immunospot, IFN-γ ELISPOT）檢測試劑盒、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素均購于瑞典Mabtech公司；堿性磷酸酶顯色劑購于美國Bio-Rad公司；抗-CD4和抗-CD8抗體包被的磁珠，磁力架（Dynabeads; Invitrogen）；FITC Mouse Anti-Human CD8和PE Mouse Anti-Human CD4購于美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 EV71 VP1和RdRp蛋白基因序列重疊肽庫的建立 根據(jù)EV71/HubeiChina/2009病毒株（基因號GU434678.1）C4亞型VP1和RdRp蛋白氨基酸基因序列設(shè)計。通過生物信息技術(shù)設(shè)計并合成36條覆蓋VP1蛋白和57條覆蓋RdRp蛋白基因序列重疊多肽，重疊多肽由自動多肽合成機(jī)合成，其中每條多肽由15～20個氨基酸組成，相鄰多肽間10個氨基酸重疊。

1.3.2 分離外周血單個核細(xì)胞及磁珠分選CD4+、CD8+T細(xì)胞 取肝素鈉抗凝新鮮外周靜脈血約20 m1，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。采用陰性磁珠分選法，在PBMCs中分別加入結(jié)合磁珠的抗體，吸取獲得不含有CD4+和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞，同時采用流式細(xì)胞方法檢測CD4+、CD8+T細(xì)胞的純度達(dá)98%以上，且驗證發(fā)現(xiàn) RdRp蛋白特異性T細(xì)胞總數(shù)與CD4+和CD8+T細(xì)胞之和的反應(yīng)強(qiáng)度無差異。

1.3.3 體外IFN-γ ELISPOT法 包被：終濃度10 μg/ml抗人IFN-γ抗體包被96孔PVDF膜酶標(biāo)板，4 ℃過夜。加樣：分別加實驗組重疊肽庫5 μl（每條肽段終濃度為 2.5 g/ml）和 100 μl細(xì)胞 [（0.5 ～ 10）×105個細(xì)胞]，陽性對照組為同一細(xì)胞加PHA（終濃度為10 μg/ml）5 μl，陰性對照組為同一細(xì)胞加完全1640培養(yǎng)液 5 μl，置于 37 ℃、5%CO2孵箱中過夜（12～18 h）。顯色：加入終濃度為1 μg/ml生物素標(biāo)記的抗人INF-γ抗體100 μl，室溫放置2 h；洗板，每孔加50 μl堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶1000），室溫放置1 h，洗板后加50 μl/孔顯色劑，反應(yīng)孔出現(xiàn)藍(lán)色斑點，終止反應(yīng)。計數(shù)：讀反應(yīng)孔藍(lán)色斑點數(shù)，每個斑點代表一個特異性T細(xì)胞，用斑點形成單位（spot forming units, SFUs）/106PBMCs來表示；設(shè)定反應(yīng)孔內(nèi)SFUs＞20個，并且＞3倍陰性對照孔SFUs為陽性反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)。反應(yīng)強(qiáng)度用每106個PBMCs中SFUs數(shù)表示；反應(yīng)頻率用反應(yīng)陽性例數(shù)占全部例數(shù)的百分比表示。

2 結(jié) 果

2.1 RdRp蛋白肽庫誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞免疫反應(yīng) 采用體外IFN-γ ELISPOT技術(shù)，檢測40例健康成人的EV71 VP1和RdRp蛋白肽庫特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ反應(yīng)強(qiáng)度和陽性反應(yīng)例數(shù)（即反應(yīng)頻率）。結(jié)果顯示12例（30%）健康成人檢測到RdRp蛋白肽庫特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)度中位數(shù)為64.00 SFUs/106PBMCs；而未檢測到VP1蛋白肽庫特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答（見圖1、2）。

圖1 同一個體對EV71 VP1和RdRp肽段的T細(xì)胞反應(yīng)Figure 1 Comparison of T cell response to EV71 VP1 and RdRp peptides in one adult

2.2 RdRp蛋白特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞反應(yīng) 為進(jìn)一步區(qū)分RdRp蛋白特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，采用磁珠分選法獲取存在RdRp蛋白特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)個體的CD4+T細(xì)胞（即去除CD8 T細(xì)胞）和CD8+T細(xì)胞（即去除CD4 T細(xì)胞），再次通過體外IFN-γ ELISPOT技術(shù)檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞參與RdRp蛋白特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答（見圖3）。

圖2 EV71 RdRp特異性T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度個體分布Figure 2 Distribution of T cell responses specific for EV71 RdRp protein in each subject

圖3 同一個體體外IFN-γ ELISPOT檢測RdRp特異性CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)Figure 3 Ex vivo IFN-γ ELISPOT detection of RdRp specific CD4+ and CD8+ T cell response in one adult

2.3 RdRp蛋白特異性T細(xì)胞表位篩選 為找出RdRp蛋白區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞反應(yīng)的重疊肽段，進(jìn)行了相應(yīng)的T細(xì)胞表位篩選。將覆蓋RdRp蛋白基因序列的57條重疊肽段分為3組肽庫矩陣，RdRppool 1：RdRp1～18（第1732～1885位氨基酸）；RdRp-pool 2：RdRp19～36（第1886～2029位氨基酸）；RdRp-pool 3：RdRp37～57（第2030～2193位氨基酸），首先利用3組肽庫進(jìn)行初步篩選，然后對反應(yīng)陽性的肽庫進(jìn)行確認(rèn)實驗，分別用這3組肽庫體外刺激已知12例存在RdRp蛋白特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答陽性的個體，發(fā)現(xiàn)均可檢測到一組或更多組RdRp肽庫特異性T細(xì)胞反應(yīng)，表明RdRp蛋白具有多個T細(xì)胞表位，不同個體識別表位可能與其人類白細(xì)胞抗原表型差別有關(guān)（見表1）。

表1 EV71 RdRp肽庫中含有的T 細(xì)胞表位Table 1 EV71 RdRp peptides containing T cell epitope

3 討 論

本研究選取EV71 VP1和RdRp作為研究靶蛋白，其中VP1是EV71中和決定子，直接決定病毒的抗原性[7-8]；RdRp高度保守是病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶[9-10]。既往動物實驗表明，編碼VP1的DNA疫苗能誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[11]。我們前期研究也顯示VP1和RdRp均可誘導(dǎo)EV71感染患兒T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[6]。成人感染EV71后發(fā)病非常少見，往往作為病毒攜帶者和傳染源[12]。臺灣一項關(guān)于家庭內(nèi)密切接觸傳染的前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，每個HFMD患兒家庭中至少有一個成員有EV71感染，所有成員中52%感染EV71，其中成人為38%[13]。對EV71完全具有免疫力的成人也有超過16%沒有抗EV71中和抗體[14]，細(xì)胞免疫反應(yīng)在疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而在對EV71隱性感染者，特別是對健康成人中EV71特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究尚為空白。

本研究選取40例健康成人作為研究對象，通過重疊肽技術(shù)合成覆蓋EV71 C4亞型結(jié)構(gòu)蛋白VP1和非結(jié)構(gòu)蛋白RdRp重疊肽段作為抗原，采用IFN-γ ELISPOT和磁珠分選法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有12例（30%）健康成人檢測到RdRp蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)，RdRp蛋白誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答以特異性CD4+T細(xì)胞為主；而未檢測到VP1特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。健康成人外周血檢測到EV71 RdRp蛋白特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示這部分健康成人為EV71隱性感染或是既往感染后機(jī)體保留的免疫記憶，但是維持多久有待進(jìn)一步研究。

本研究中還鑒定了9個EV71 RdRp蛋白的T細(xì)胞表位。這些單個重疊肽段同時可以誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，說明CD4+T細(xì)胞能夠識別RdRp抗原表位。本實驗對健康成人外周血VP1和RdRp蛋白存在特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的初步探討提示：①RdRp特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答在健康成人個體中存在陽性反應(yīng)，但未檢測到VP1特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答；②健康成人RdRp特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答以CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答為主；③健康成人外周血存在特異性CD4+T細(xì)胞，可能存在EV71隱性感染或與其他腸道病毒存在交叉抗原表位；④健康成人外周血中可能存在RdRp蛋白肽庫特異性記憶T細(xì)胞，并在體內(nèi)長期維持記憶功能。該研究有助于指導(dǎo)控制EV71的流行，闡明EV71的細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制，為EV71感染防控提供重要的理論依據(jù)。

志謝感謝英國牛津大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所人類免疫中心Tao Dong教授對本實驗給予的指導(dǎo)