劉 艷 吳 彤 汪曉強 陳雪梅 蘇殿三 俞衛(wèi)鋒 田 婕

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,中國每年乳腺癌的新患病例數和死亡例數分別占全球的12.2%和9.6%[1]。乳腺癌患者常伴有血清胰島素樣生長因子Ⅰ(IGFⅠ)水平升高,且其水平與乳腺癌發(fā)病風險呈正相關[2-3]。IGFⅠ能夠促進細胞有絲分裂,抑制細胞凋亡,被認為是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展關鍵的致病因素之一[2-4]。嗎啡、芬太尼等阿片類藥物在臨床上普遍被用于乳腺癌患者手術時鎮(zhèn)痛和術后慢性癌痛的治療,然而近年來,越來越多的臨床和實驗室研究結果提示,激活體內的阿片系統(tǒng),可能會影響腫瘤的生長、侵襲和轉移。Nguyen等[5]研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌小鼠模型中使用嗎啡,能夠刺激其腫瘤發(fā)展并影響生存率。對阿片系統(tǒng)與腫瘤的進一步研究發(fā)現(xiàn),mu阿片受體(MOR)作為臨床常用阿片類藥物的主要結合靶點,在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均具有不容忽視的作用[6-7]。Lennon等對非小細胞肺癌細胞系細胞轉染MOR過表達質粒后發(fā)現(xiàn),細胞中MOR蛋白表達水平升高伴隨著腫瘤相關信號通路磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)的明顯激活,以及細胞增殖、轉移能力的顯著增強。對IGFⅠ致乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制研究顯示,IGFⅠ與其受體(IGFⅠR)結合后,通過其受體底物磷酸化,激活PI3K/Akt信號通路,從而促進細胞增殖和腫瘤進展[8-9]。本研究旨在探討在乳腺癌的發(fā)展過程中,阿片系統(tǒng)與IGFⅠ系統(tǒng)之間的關系,以及MOR對IGFⅠ致乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院上海細胞庫。采用含10%FBS、100 U/mL青霉素、鏈霉素的無酚紅DMEM完全培養(yǎng)液,于37℃、體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),隔天換液,2～3 d傳代。

1.2 Western印跡法檢測MOR蛋白表達 在MCF-7細胞培養(yǎng)液的上清液中加入不同質量濃度(20、100、1 000μg/L)的IGFⅠ培養(yǎng)24 h。此外,以質量濃度為100μg/L的IGFⅠ刺激MCF-7細胞15、30 min和1、6、12、24 h。對照組均加入等量培養(yǎng)液,每組設3個復孔。細胞生長至亞融合狀態(tài)時,收集細胞,以細胞裂解液冰浴裂解30 min。蛋白定量按二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)說明書方法操作。以總蛋白量20μg/孔按Bio-Rad試劑盒說明書進行10%SDS-PAGE變性電泳。電泳完畢,將凝膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。Western印跡法所用一抗為兔抗人MOR多克隆抗體(1∶1 000,英國Abcam公司),二抗采用HRP標記山羊抗兔IgG(1∶2 000,上海碧云天生物技術有限公司),以化學發(fā)光試劑盒顯色。內參采用GAPDH。應用Image labTM軟件分析蛋白條帶灰度值,MOR蛋白表達水平以對照組的MOR與GAPDH的比值作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.3 細胞周期檢測 取對數生長期MCF-7細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h作同步化處理后,分別單獨或聯(lián)合加入100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO(選擇性MOR激動劑),對照組加入等量培養(yǎng)液。每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,用預冷的PBS洗2次,逐滴加入70%冰乙醇,于-20℃固定過夜,100×g離心5 min后,加入碘化丙啶染色液,室溫避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期,應用Modfit LT 5.0軟件進行分析,處于增殖期的細胞數量以對照組S期細胞占細胞總數的百分比作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.4 細胞活力檢測 以0.25%胰蛋白酶消化對數生長期單層培養(yǎng)細胞,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單細胞懸液,調整細胞密度為1×105/mL,以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板。接種18 h換無血清培養(yǎng)液饑餓過夜后,分別單獨或聯(lián)合加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO和1μmol/L甲基納曲酮(MNTX,MOR特異性拮抗劑),對照組加入等量培養(yǎng)液。每組設6個復孔。在37℃、體積分數為0.05的CO2條件下培養(yǎng)24 h后,每孔加入10μL細胞計數試劑盒8(CCK-8)溶液,繼續(xù)孵育1 h后,應用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值,以對照組的A值作為1,其他各組的值以與對照組的比值表示。

1.5 Western印跡法檢測磷酸化Akt(p-Akt)表達在MCF-7細胞培養(yǎng)液的上清液中單獨或聯(lián)合加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的100μg/L IGFⅠ、10μmol/L DAMGO和1μmol/L MNTX,對照組加入等量培養(yǎng)液,在37℃、體積分數為0.05的CO2條件下培養(yǎng)24 h。每組設3個復孔。Western印跡法的操作方法同前,將一抗改為兔抗人Akt和p-Akt多克隆抗體(1∶1 000,美國Cell signaling technology公司)。p-Akt的相對表達量以p-Akt與總Akt的灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件。對于連續(xù)性計量資料,首先采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗分析其是否符合正態(tài)分布,符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。所有檢驗均為雙側檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 IGFⅠ誘導MCF-7細胞中MOR蛋白高表達Western印跡法結果顯示,以20、100、1 000μg/L不同質量濃度IGFⅠ刺激24 h,MCF-7細胞中MOR蛋白的相對表達水平分別為1.32±0.04、1.54±0.10和1.10±0.06,IGFⅠ為20和100μg/L時MOR蛋白的相對表達水平均顯著高于對照組(P值均＜0.01),在IGFⅠ質量濃度為100μg/L時作用最顯著,見圖1。以100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞15和30 min,以及1、6、12和24 h時 MOR蛋白的表達水平分別為1.38±0.21、1.39±0.14、1.69±0.12、1.80±0.14、1.64±0.14和1.75±0.22,刺激15 min時MOR蛋白即開始升高,刺激30 min和1、6、12、24 h時均顯著高于對照組(P值分別＜0.05、0.01),在刺激6 h時作用達到高峰,見圖2。

圖1 Western印跡法檢測不同質量濃度IGFⅠ刺激24 h后MCF-7細胞中MOR蛋白的表達

圖2 Western印跡法檢測100μg/L IGFⅠ刺激不同時間后MCF-7細胞中MOR蛋白的表達

2.2 活化MOR促進IGFⅠ致乳腺癌細胞增殖的作用 流式細胞術檢測細胞周期的結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,處于增殖期的細胞數量為5.39±0.19,顯著多于對照組(P＜0.01);而采用10μmol/L DAMGO預處理2 h后再與IGFⅠ共同刺激24 h,處于增殖期的細胞數量進一步增多至6.20±0.01,顯著高于對照組和IGFⅠ單獨刺激組(P值均＜0.01);而DAMGO單獨刺激組處于增殖期的細胞數量為0.97±0.07,與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

CCK-8檢測細胞活力的結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,細胞活力為1.33±0.03,顯著高于對照組(P＜0.01);而10μmol/L DAMGO預處理2h后再聯(lián)合IGFⅠ共同刺激,細胞活力進一步增高至1.45±0.04,顯著高于對照組和IGFⅠ單獨刺激組(P值分別＜0.01、0.05);而DAMGO單獨刺激組的細胞活力為0.97±0.02,與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),以上結果與細胞周期的檢測結果一致。此外,MCF-7細胞單獨用1μmol/L MNTX預處理2 h,細胞活力為0.96±0.02,與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);MNTX預處理2 h后再與IGFⅠ共同刺激,細胞活力為1.40±0.06,與IGFⅠ單獨刺激組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);但在DAMGO與MNTX同時預處理2 h后再給予IGFⅠ,IGFⅠ與DAMGO聯(lián)合誘導的MCF-7細胞增殖被明顯抑制,此時細胞活力為1.21±0.05,顯著低于IGFⅠ與DAMGO聯(lián)合刺激組(P＜0.01)。

2.3 活化MOR提高了IGFⅠ誘導的Akt激活Western印跡法檢測結果顯示,采用100μg/L IGFⅠ刺激MCF-7細胞24 h后,p-Akt的相對表達水平為0.22±0.02,顯著高于對照組的0(P＜0.01);10μmol/LDAMGO預處理2 h后再給予100μg/L IGFⅠ刺激24 h,p-Akt的相對表達水平進一步升高至0.44±0.07,顯著高于IGFⅠ單獨刺激組(P＜0.01)。MCF-7細胞單獨用DAMGO或MNTX預處理2 h,p-Akt的相對表達水平均為0,與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P值均＞0.05)。DAMGO和MNTX同時預處理2 h后再給予IGFⅠ,其p-Akt的相對表達水平被明顯抑制至0.28±0.01,顯著低于IGFⅠ與DAMGO聯(lián)合刺激組(P＜0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡法檢測IGFⅠ、DAMGO、MNTX單獨或聯(lián)合刺激后MCF-7細胞中p-Akt的表達

3 討 論

國際癌癥研究機構(IARC)公布的2012年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數據顯示,乳腺癌的新發(fā)病例數占所有女性腫瘤新發(fā)布例數的1/4,死亡人數超過5萬。中國原屬于乳腺癌低發(fā)國家,但自20世紀90年代以來,隨著我國城鎮(zhèn)化的進程,其發(fā)病率呈快速上升趨勢,如今乳腺癌已成為中國女性發(fā)病率最高的腫瘤,居癌癥相關死亡原因的第6位[1]。

乳腺癌是一種全身性疾病,目前認為與其發(fā)病相關的因素包括月經初潮早絕經晚、遺傳因素、不健康的飲食和生活方式、激素和藥物的使用等,但其具體發(fā)病機制仍不清楚。近年來,胰島素樣生長因子系統(tǒng)(IGFs)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用逐漸受到關注,其中IGFⅠ具有較強的促有絲分裂原性和抗凋亡活性,IGFⅠ在組織中的生物活性與其在循環(huán)血清中的水平呈正相關。國內外研究[2-3,10]顯示,乳腺癌患者血清中IGFⅠ水平明顯高于乳腺正常和良性疾病患者。動物實驗為IGFⅠ致乳腺癌的作用機制研究提供了更直接的證據。本課題組的前期研究[11]發(fā)現(xiàn),與野生型姐妹小鼠相比,IGFⅠ轉基因(Tg)小鼠的自發(fā)乳腺癌、低劑量或高劑量致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)致乳腺癌發(fā)病率均明顯較高,且發(fā)病潛伏期顯著縮短。對IGFⅠ致病機制的研究[8]提示,IGFⅠ主要通過與其受體(IGFⅠR)結合,導致受體底物如胰島素受體底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化,進而激活PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路,引起細胞周期蛋白D1(cyclin D1)在細胞核中聚集,從而促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生侵襲、轉移。

乳腺癌是一種具有高度異質性的腫瘤,其預后除了與分子表型、腫瘤組織學分級等疾病本身的因素有關外,與手術、放射和化學治療等處理因素也密切相關。手術是乳腺癌患者重要的治療方式,其各個環(huán)節(jié)都可能影響腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉移。阿片類藥物是臨床上最主要的麻醉和鎮(zhèn)痛藥物之一,其對腫瘤患者手術后遠期復發(fā)和轉移的影響一直是近年來研究的熱點。Gupta等[12]通過在體和離體實驗均發(fā)現(xiàn),臨床常用劑量的嗎啡可以通過與G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)結合,激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)和PI3K/Akt信號通路,從而促進人血管內皮細胞增殖和新生血管形成,最終加速乳腺癌進展。而Janku等[13]通過一項隨機安慰劑對照試驗也發(fā)現(xiàn),使用MOR特異性拮抗劑MNTX可以提高晚期癌癥患者的總體生存率。此外多項研究結果提示,阿片類藥物可以不同程度地抑制機體抗腫瘤免疫系統(tǒng)的功能。一項臨床研究[14]結果顯示,七氟烷麻醉聯(lián)合術后芬太尼鎮(zhèn)痛能顯著抑制乳腺癌患者術后外周血中自然殺傷細胞(NK細胞)的活性。這些實驗室和臨床研究結果均提示,MOR作為阿片類藥物的主要結合靶點,可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究探討MOR在IGFⅠ介導的乳腺癌發(fā)病中的作用機制,發(fā)現(xiàn)將IGFⅠ加入培養(yǎng)液上清液中刺激人乳腺癌細胞系MCF-7能夠上調其MOR蛋白表達水平。由此推測,IGFⅠ誘導MOR表達上調可能參與其致乳腺癌進展的機制機制,CCK-8法檢測細胞增殖/凋亡和流式細胞術檢測細胞周期的實驗結果均證實了該推測。外源性MOR激動劑DAMGO能進一步上調IGFⅠ對MCF-7細胞增殖的促進作用,而MOR特異性拮抗劑MNTX能夠逆轉DAMGO的作用,使細胞增殖水平回落。這一作用可能通過進一步提高Akt信號通路的激活水平介導。值得注意的是,在無IGFⅠ刺激的情況下,單獨激活或阻斷MOR對細胞增殖并無影響。細胞增殖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,持續(xù)的細胞增殖被認為是腫瘤細胞的基本特征之一,也是腫瘤發(fā)生的重要機制,細胞增殖能力的增強能促進腫瘤的生長和轉移。臨床患者中,腫瘤細胞增殖能力較強往往預示著腫瘤預后不良。因此本研究結果提示,MOR可能與IGFⅠ相互作用,共同促進乳腺癌細胞增殖,從而影響患者術后的轉歸。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)IGFⅠ能上調乳腺癌細胞中MOR的表達,高表達的MOR在外源性激動劑的刺激下,可能通過提高Akt信號通路在IGFⅠ作用下的激活水平,參與IGFⅠ致乳腺癌細胞惡性增殖的作用,且該作用可以被MOR特異性拮抗劑阻斷。今后有待進行更深入的研究,進一步揭示阿片系統(tǒng)在IGFⅠ相關性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,為臨床上這類乳腺癌的防治提供新思路和靶點,也為該類患者手術時制定合理的麻醉與鎮(zhèn)痛方案提供有價值的參考。