■ 李 潔 李 昆 張孟陽 王德培，4*

(1.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.中糧（北京）飼料科技有限公司，北京102209；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；4.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

木薯酒精渣是全木薯發(fā)酵制取酒精后的副產(chǎn)物，水分含量高達(dá)85%而且酸度大，并含大量粗纖維和粗灰分，無法在常溫下保存，極易腐敗變質(zhì)造成環(huán)境污染，即使作為飼料進(jìn)行飼喂，適口性比較差，動物難以消化吸收，成為木薯全渣發(fā)酵酒精的主要固廢物，是生產(chǎn)企業(yè)無法處理的固廢污染難題。以木薯酒精渣為主要原料進(jìn)行發(fā)酵飼料研制，人為控制的條件下，以工業(yè)副產(chǎn)物木薯渣為主要原料，以玉米淀粉渣、玉米皮、濕法糖渣等工業(yè)副產(chǎn)品作為碳源和氮源的補(bǔ)充料，添加碳酸鈣等作為緩沖劑，通過枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物自身的生長代謝作用，改變木薯渣的物理、化學(xué)性質(zhì)。具體就是分解部分粗纖維、粗蛋白等大分子物質(zhì)，生成單糖、雙糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，不僅提高了飼料的消化吸收率，而且起到深度生化加工作用[1]。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生并積累大量營養(yǎng)豐富的微生物菌體蛋白及其它有用的代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、醇、酯、維生素、微量元素等，使飼料變軟變香，增加營養(yǎng)，最終形成適口性好、營養(yǎng)豐富、活菌含量高的生物飼料[2]。湯小朋等[3]研究黑曲霉固態(tài)發(fā)酵對木薯渣品質(zhì)的影響，最優(yōu)條件發(fā)酵后結(jié)果表明：與對照組相比，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)，粗纖維含量由22.26%降低到17.71%，還原糖含量由1.42%提高到5.11%，粗蛋白質(zhì)含量由8.67%提高到13.48%，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%，粗灰分含量由6.02%提高到7.31%，顯著提高木薯渣的營養(yǎng)價值。畜禽日糧中添加木薯渣的研究很多，蔣建生等[4]研究表明，在肉鴨育雛期（1～14日齡）添加1%發(fā)酵木薯渣飼料替代全價飼料有利于促進(jìn)雛鴨飼料轉(zhuǎn)化。潘慧華等[5]研究結(jié)果表明，在肉用鴨的0～2周齡、3～4周齡和5～7周齡日糧中分別添加2%、4%和8%的木薯渣用來替代三七糠既能滿足肉鴨對粗纖維的需求，同時降低飼料的成本。于向春等[6]用不同復(fù)合菌劑發(fā)酵木薯渣，以不同的比例進(jìn)行混合替代文昌雞飼料，結(jié)果對文昌雞的生長影響不大，所以發(fā)酵木薯渣可替代部分文昌雞飼料以降低成本。張偉濤等[7]將不同發(fā)酵方式處理后的木薯渣添加到羅非魚的飼料中，既能被魚體充分吸收利用，又能滿足羅非魚正常的營養(yǎng)需求。蔡永權(quán)等[8]研究表明，以青貯木薯渣為主料，搭配2 kg精料添加，18～25月齡肉牛平均日增重達(dá)到0.591 kg，飼養(yǎng)成本被降低，質(zhì)量增速較快，可以獲得不錯的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5；產(chǎn)乳酸菌：凝結(jié)芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 木薯渣固體發(fā)酵飼料配方

木薯渣70%、玉米淀粉渣20%、玉米皮10%。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，NaCl 10 g/l，pH值7.2。

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨10 g/l，NaCl 5 g/l，pH值7.2～7.4。

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨5 g/l，NaCl 5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，瓊脂18 g/l，pH值7.2。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l，牛肉膏10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，葡萄糖 5 g/l，CH3COONa 5 g/l，檸檬酸二胺2 g/l，吐溫-80 1 g/l，K2HPO42 g/l，MgSO4·7H2O 0.2 g/l，MnSO4·7H2O 0.05 g/l，CaCO320 g/l，pH值6.2。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/l，乳糖10 g/l，牛膽鹽 5 g/l，NaCl 5 g/l，中性紅0.03 g/l，瓊脂18 g/l，pH值7.0。

1.3.2 芽孢桿菌種子液制備

從LB培養(yǎng)基斜面上挑取1環(huán)菌，接入到裝有50 ml肉湯培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.3 產(chǎn)乳酸菌種子液制備

從MRS液體培養(yǎng)基中吸取1 ml培養(yǎng)液，接入到裝有50 ml MRS液體培養(yǎng)基的250 ml廣口瓶中，放置于溫度37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 h。

1.3.4 木薯渣固態(tài)發(fā)酵飼料

將枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5、凝結(jié)芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌菌液按比例與一定量的水混合，然后與木薯渣飼料混勻，裝入發(fā)酵袋中培養(yǎng)。

1.3.5 乳酸含量的測定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有50 ml蒸餾水的250 ml的三角瓶里，充分搖勻并浸提1 h，之后離心取上清液，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后用生物傳感分析儀測定其中的乳酸含量。

1.3.6 活菌數(shù)的測定[9]

芽孢桿菌用可溶性淀粉固體培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基；產(chǎn)乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基；大腸桿菌用麥康凱固體培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基。

1.4 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

1.4.1 兩株芽孢桿菌混合比例的確定

選取兩株芽孢桿菌比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3這5個水平進(jìn)行分析。

1.4.2 兩株產(chǎn)乳酸菌混合比例的確定

選取兩株產(chǎn)乳酸菌比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3這5個水平進(jìn)行分析。

1.4.3 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例的確定

選取芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為1∶2、2∶1、1∶1、3∶1、3∶2這5個水平進(jìn)行分析。

1.4.4 總接種量的確定

選取接種量為1%、3%、5%、7%、9%這5個水平進(jìn)行分析。

1.5 發(fā)酵溫度的確定

選取溫度為22、27、32、37、42 ℃這5個水平進(jìn)行分析。

1.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9(33)型三水平三因素正交表，以芽孢菌與乳酸菌的接種比例、接種量、發(fā)酵溫度3個因素作為考察因素，研究對發(fā)酵結(jié)果的影響。

1.7 育肥豬飼喂試驗(yàn)

1.7.1 試驗(yàn)動物和分組

將120日齡60頭70 kg左右的健康的“杜×大×長”三元雜交生長肥育豬隨機(jī)分成4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5頭豬。

1.7.2 試驗(yàn)日糧與設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)4個處理組，即對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，分別飼喂0、5%、15%、25%不同比例木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧(見表1)。基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)水平參照NRC(2012)推薦量平衡日糧中的能量和各種營養(yǎng)物質(zhì)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.7.3 飼養(yǎng)管理

進(jìn)豬前要檢查維修圈舍設(shè)備，并清掃圈舍，然后用2%火堿水溶液或其它消毒藥消毒。按豬的體重、體質(zhì)強(qiáng)弱等相近的原則分4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)5頭。進(jìn)入豬舍后，舍內(nèi)溫度控制在16～21℃之間，相對濕度50%～70%之間，保持空氣流通。自由采食，自由飲水，采用全自動飲水裝置，預(yù)試期為3 d，正試期為30 d，每天清掃圈舍和除糞2次，保證豬舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生良好，每周舍內(nèi)通道用2%火堿溶液或其它消毒藥消毒1次。平時經(jīng)常觀察豬群采食、排糞情況、健康狀況和精神狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)疫病及時隔離治療。每周統(tǒng)計試驗(yàn)豬采食量和增重，及時檢測試驗(yàn)豬糞便中的微生物。

1.7.4 測定指標(biāo)

生長性能指標(biāo)：分別于試驗(yàn)的開始和結(jié)束對所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重，根據(jù)每個圈舍試驗(yàn)豬的總重量和頭數(shù)來計算平均頭重，再根據(jù)平均頭重的初重和末重來計算出平均日增重。每周要記錄各組試驗(yàn)豬的采食量，試驗(yàn)結(jié)束后結(jié)算各組試驗(yàn)豬消耗飼料的總重，計算出平均日采食量。根據(jù)平均日增重和平均日采食量計算料重比。

糞便中微生物的測定：分別在試驗(yàn)第15 d和第30 d時，即整個試驗(yàn)時期的中期和末期，進(jìn)行豬糞便中微生物的測定，分別取每組試驗(yàn)豬1 h內(nèi)的新鮮豬糞，并盡量取多只豬的糞便，然后混勻，準(zhǔn)確稱取糞便5 g置于裝有生理鹽水的三角瓶中，瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠，震蕩15 min，使糞便中的微生物懸浮于生理鹽水中，然后用十倍稀釋法進(jìn)行稀釋，選取合適的稀釋梯度進(jìn)行涂布計數(shù)。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基，大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基作為計數(shù)培養(yǎng)基。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯渣發(fā)酵飼料兩株枯草芽孢桿菌混合比例的優(yōu)化（見表2）

表2 兩株芽孢菌混合比例對木薯渣發(fā)酵飼料的影響

從表2可以看出，兩株枯草芽孢桿菌的比例對乳酸含量和活菌總數(shù)都有影響，但影響都較小，比例為1∶2時，活菌總數(shù)有較高水平，乳酸含量也最高，從而確定木薯渣發(fā)酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2。

2.2 木薯渣發(fā)酵飼料兩株產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌混合比例的優(yōu)化（見表3）

從表3可以看出，兩株產(chǎn)乳酸菌的混合比例為1∶2時，活菌總數(shù)最高，但乳酸含量較低，當(dāng)比例為1∶3時，乳酸含量最高，活菌總數(shù)也處于較高水平，從而確定木薯渣發(fā)酵飼料中發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1∶3。

2.3 木薯渣發(fā)酵飼料芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例的優(yōu)化（見表4）

木薯渣發(fā)酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2，發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1∶3，而芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合接種比例見表4。

從表4可以看出，芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例對乳酸菌數(shù)影響相對較小，芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例為3∶2時，乳酸含量最高，且乳酸菌數(shù)也有較高的水平，所以確定木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3∶2。

表3 兩株產(chǎn)乳酸菌混合比例對木薯渣發(fā)酵飼料的影響

表4 芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌混合比例對木薯渣發(fā)酵飼料的影響

2.4 木薯渣發(fā)酵飼料總接種量的優(yōu)化

木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3∶2，總接種量見表5。

表5 接種量對木薯渣發(fā)酵飼料的影響

從表5可以看出，當(dāng)接種量超過5%以后，隨著接種量的增加，乳酸含量增加效果并不明顯，而且接種量太高，在生產(chǎn)過程中發(fā)酵飼料所需要的菌液也會很高，這樣會增加生產(chǎn)成本，從結(jié)果可以看出，5%的接種量各個指標(biāo)也處于較高水平，所以最終確定接種量為5%。

2.5 木薯渣發(fā)酵飼料溫度的優(yōu)化

兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2，發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的比例為1∶3，木薯渣發(fā)酵飼料中芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌比例為3∶2，總接種量5%。發(fā)酵溫度見表6。

表6 溫度對木薯渣發(fā)酵飼料的影響

從表6可以看出，在22℃和27℃較低溫度木薯渣飼料不能很好地進(jìn)行發(fā)酵，乳酸含量和產(chǎn)乳酸菌數(shù)很低，這說明低溫使菌體的生長代謝受到抑制，從而影響產(chǎn)酸性能。在42℃較高溫度下發(fā)酵雖然能達(dá)到一定的發(fā)酵效果，但是溫度過高也會抑制菌株的生長，致使乳酸菌數(shù)少于在32℃和37℃發(fā)酵的結(jié)果。從結(jié)果可以看出，37℃下發(fā)酵效果很好，乳酸含量和乳酸菌數(shù)都達(dá)到較好的結(jié)果。

2.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

以單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件，采用L9(33)型三水平三因素正交試驗(yàn)研究芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌的接種比例、總接種量、發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見表7。

表7 正交試驗(yàn)設(shè)計各因素及水平

以乳酸含量作為指標(biāo)進(jìn)行分析，如表8和表9所示。

表8 正交試驗(yàn)極差分析

表9 以發(fā)酵飼料中乳酸結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析

通過正交試驗(yàn)中各組發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行分析可以看出各因素?zé)o顯著性影響，影響因子的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞接種比例＞接種量，從K值可以看出，A2B2C3發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸最多，接種比例為3∶2，接種量為5%，發(fā)酵溫度37℃。對A2B2C3這一組再次重復(fù)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，測得發(fā)酵后乳酸含量達(dá)到2.0%。

2.7 木薯渣發(fā)酵飼料對育肥豬生長性能的影響（見表10）

育肥豬飼喂到150日齡時，由表10可知，對照組末重遠(yuǎn)高于試驗(yàn)Ⅲ組，差異顯著，略高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組的末重較為一致，也高于試驗(yàn)Ⅲ組。從平均日增重來看，試驗(yàn)Ⅱ組添加15%木薯渣發(fā)酵飼料的結(jié)果最高。從料肉比來看，對照組料肉比最低，與試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組差異并不大，但低于試驗(yàn)Ⅲ組的結(jié)果，可見添加適量木薯渣發(fā)酵飼料的可以刺激試驗(yàn)育肥豬的采食，但是不宜添加過量。

2.8 育肥豬糞便中微生物的測定（見表11）

表10 木薯渣發(fā)酵飼料對育肥豬生長性能的影響

表11 豬糞中微生物的檢測結(jié)果

通過對各組豬糞中大腸桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)以及芽孢桿菌數(shù)的測定，從表11可以看出，試驗(yàn)Ⅱ組乳酸菌數(shù)最高，芽孢桿菌數(shù)也有較高水平，但四組之間沒有顯著差異。飼料經(jīng)過發(fā)酵后，豬采食后未能改善豬腸道內(nèi)微生物環(huán)境，也可能與飼喂時間短有關(guān)。

3 結(jié)論

按最優(yōu)發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，總接種量為5%，枯草芽孢桿菌BI1與枯草芽孢桿菌B10-5接種比例為1∶2，產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌接種比例為1∶3，芽孢桿菌與產(chǎn)乳酸菌接種比例為3∶2，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵后木薯渣乳酸含量達(dá)到2%。添加不同比例木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧進(jìn)行育肥豬飼喂試驗(yàn)，結(jié)果顯示飼喂添加15%木薯渣發(fā)酵飼料的基礎(chǔ)日糧的試驗(yàn)組具有較好的增重效果，平均日增重0.78 kg，平均日采食量2.8 kg，料肉比3.59，同時腸道內(nèi)乳酸菌數(shù)量增加。由此可見，木薯渣發(fā)酵飼料可以部分代替基礎(chǔ)日糧添加，并且具有較好的飼喂效果。