◎ 梁梅娟，蘇佩冰，殷 歡，陳靖欣

（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）被發(fā)現(xiàn)已有100年的歷史，其在害蟲防治中發(fā)揮了巨大的作用，是近年來研究最深入、開發(fā)最迅速、應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑。Bt的防蟲原理是其菌株可產(chǎn)生內(nèi)毒素（伴孢晶體）和外毒素兩類毒素，使害蟲停止取食，害蟲均因饑餓、細胞壁破裂、血液敗壞和神經(jīng)中毒而死。近年來，國內(nèi)外學者對蘇云金桿菌的菌種資料、分類鑒定、伴孢晶體結(jié)構(gòu)、血清學特征等方面均進行了廣泛而深入的研究[1]。

Bt與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）同屬于蠟狀芽孢桿菌菌群，為自然界中廣泛分布的革蘭陽性菌[2]。Bt與Bc在DNA水平上具有較高的同源性，只有個別堿基有差異，此外，Bt與Bc還有相似的生化特征，區(qū)別在于Bt能產(chǎn)生伴孢晶體[3]。目前，對于Bt的鑒定一般運用傳統(tǒng)的生化試驗來進行，耗時較長，試驗結(jié)果不穩(wěn)定且不易與Bc區(qū)分?；蛑讣y分析（Ribo Printer，RP）系統(tǒng)是杜邦公司研發(fā)的一種全自動細菌鑒別系統(tǒng)，該系統(tǒng)建立在對核糖體DNA序列多態(tài)性分析之上[4]，可以全自動完成細菌鑒定的一系列實驗。本文參考GB 4789.14-2014《食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗》[5]，運用傳統(tǒng)的生化試驗結(jié)合VITECK-2-compact及RP系統(tǒng)對Bt進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）菌株。Bt（A TCC 10792）、Bc[CMCC（B）63303]、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides，Bm）（ATCC 10206）。

（2）培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

（3）試劑。陸橋蠟樣芽胞桿菌生化鑒定盒、革蘭氏陽性細菌鑒定卡BCL卡、RiboPrinter鑒定試劑盒及配套試劑（裂解液：苯酚：氯仿：異戊醇 =25∶24∶1）。

（4）儀器。VITECK-2-compact全自動細菌鑒定儀、RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

將菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。

1.2.2 菌種的鑒定

（1）鏡檢.挑取NA平板上的單個菌落，涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

（2）生化特征反應(yīng)。過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、溶菌酶耐性試驗、葡萄糖利用（厭氧）、V-P試驗、甘露醇試驗、明膠試驗以及西蒙氏檸檬酸鹽試驗均來自陸橋蠟樣芽孢鑒定試劑盒，操作步驟參照試劑盒說明書進行。

（3）酪蛋白分解和溶血試驗。挑取單菌落分別接種于酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基和TSSB瓊脂平板上，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，觀察菌落性狀。

（4）根狀生長試驗。挑取單個菌落按間隔2～3 cm的距離劃平行直線于營養(yǎng)瓊脂平板上，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，觀察生長情況。

（5）蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗方法。參照GB 4789.14-2003進行。結(jié)晶試驗過程中的注意事項：培養(yǎng)完的菌株需室溫放置3 d以上，挑取少許培養(yǎng)物均勻涂在玻片上形成薄膜；在染色過程中，滴上堿性復紅后放在火焰上加熱的時候，需要注意不能讓染色液沸騰或者燒干，適當?shù)臅r候需要添加染液；最后要把玻片沖洗干凈。

（6）VITECK-2-compact。使用BCL鑒定卡進行鑒定，時間為14.25 h，具體步驟按照操作規(guī)程以及BCL鑒定卡說明書和相關(guān)文獻資料進行[6-7]。

（7）RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)。在1.5 mL PCR管中加入40 μL緩沖溶液，用取樣棒挑取待測菌株的單菌落2～3個，混合均勻，95 ℃加熱25 min，加入5 μL裂解液，放置于樣品孔中并運行程序，選用EcoRⅠ酶切系統(tǒng)。將上機得出的雜交圖譜與Dupont ID數(shù)據(jù)庫比對，得到菌株信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)分析

Bt在NA上菌落為圓形或者橢圓形，淡黃色，邊緣不規(guī)則，不透明微隆起呈滴蠟狀。Bc在NA上的形態(tài)為淡黃色，不透明，邊緣不規(guī)則，呈滴蠟狀或毛玻璃狀。Bm為白色菌落，邊緣不規(guī)則，菌落表面有絨毛生長。

Bt菌體在顯微鏡下呈紫色橢圓形桿狀，大小為（1.2～1.8）μm×（3.0～5.0）μm，呈短鏈或者長鏈狀排列，芽孢為橢圓形，靠近中間生長，芽孢囊微膨大。Bc菌體在顯微鏡下呈紫色橢圓形桿狀，大小為（1.0～1.3）μm×（3.0～5.0）μm，芽孢呈橢圓形位于菌體中央或者兩端，不會膨大于菌體，多呈短鏈或者長鏈狀排列。Bm菌體在顯微鏡下呈長桿狀，兩端為圓形，呈鏈狀排列，芽孢為橢圓形，靠近中生。

所觀察到形態(tài)現(xiàn)象都符合伯杰細菌手冊所記錄的形態(tài)特征。根據(jù)形態(tài)，可將Bm區(qū)分出來，但Bt和Bc兩者的形態(tài)很接近，很難區(qū)分。

2.2 生理生化試驗

對菌株進行了12項生化試驗，結(jié)果見表1。Bt的多數(shù)生化特征與Bc、Bm都是相同的：過氧化氫酶陽性，硝酸鹽還原陽性，溶菌酶耐性陽性，V-P反應(yīng)陽性，葡萄糖發(fā)酵都產(chǎn)酸，對甘露醇都不發(fā)酵酸，動力試驗都沒有擴散生長，明膠試驗陽性。生化特征顯著不同的是：Bt和Bc都分解酪蛋白，Bm不分解酪蛋白；溶血試驗：Bt和Bc都有明顯的溶血環(huán)，而Bm只是呈現(xiàn)很弱的溶血現(xiàn)象；Bt和Bc呈粗糙山谷狀生長，Bm呈根狀生長特征；西蒙氏檸檬酸鹽試驗只有Bc是陽性。

表1 Bt與其他芽孢桿菌生化特征的區(qū)別表

2.3 蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗

伴孢晶體的形成是Bt的重要生化特征，也是其在微生物分類時的重要依據(jù)[8]。在顯微鏡下明顯能觀察到Bt有游離芽孢和深紅色的菱形蛋白晶體，見圖1，而Bc和Bm只觀察到游離芽孢。

圖1 Bt的伴孢晶體染色圖

2.4 VITECK-2-compact鑒定結(jié)果

VITECK-2-compact是應(yīng)用經(jīng)典的生化反應(yīng)進行細菌鑒定的全自動儀器。Bt、Bc和Bm經(jīng)BCL TEST KIT VITEK 2鑒定，鑒定結(jié)果都是顯示Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides。結(jié)果分析表明，VITECK-2-compact所運用的生化反應(yīng)不能把這3種芽孢桿菌單獨鑒定出來，要確定待測菌株是否為Bt，需要補充蛋白質(zhì)結(jié)晶試驗，詳細分析見表2。

表2 VITECK-2-compact鑒定結(jié)果分析表

2.5 RP系統(tǒng)對待測菌株的鑒定結(jié)果

待測菌株ATCC10792、CMCC（B）63303和ATCC 10206經(jīng)過RP系統(tǒng)分析都出現(xiàn)了清晰的DNA指紋圖譜。結(jié)果表明，數(shù)據(jù)庫中與待測菌株ATCC 10792、CMCC（B）63303和 ATCC 10206與 Dupont相 似度較高的菌株分別為Bt、Bc和Bm，相識度均達到90%以上。

用RP系統(tǒng)對Bt的鑒定，避免了其他因素的干擾，用時較短，8 h就可以得出結(jié)果。表3就是經(jīng)過RP系統(tǒng)對Bt分析出來的結(jié)果，從表3中可以看出，第6組是待測菌株ATCC 10792的基因指紋圖譜，第1～5組是待測菌株與數(shù)據(jù)庫中基因指紋圖譜相識度較高的基因條帶。從圖中第3組和第4組可知，Bt與Bc的基因條帶的相識度比較高。不過從表3的結(jié)果分析圖上可以得出運用RP系統(tǒng)鑒定Bt，還需要結(jié)合其生化反應(yīng)才能確認最終結(jié)果。

表3 Bt的鑒定結(jié)果分析表（基因指紋圖譜）

3 結(jié)論

無論是運用全自動細菌鑒定分析儀還是RP系統(tǒng)鑒定Bt，最終都需要結(jié)合革蘭氏染色鏡檢和蛋白毒素結(jié)晶試驗，才能確定待測菌株為Bt。如果三者皆符合，則確認該菌株為Bt，如果其中之一不符合，則被否定。因為無論是運用RP系統(tǒng)和全自動生化分析儀對Bt進行鑒定，最終得出的結(jié)果都是需要結(jié)合其特征生化反應(yīng)來確認結(jié)果。通過革蘭氏染色鏡檢進一步確認菌株的形態(tài)，蛋白毒素結(jié)晶試驗是Bt的生化特征反應(yīng)，因此需要結(jié)合這兩項試驗才能確認最終結(jié)果。

全自動生化分析儀所用實驗時間長一些，并且不能把蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌分出來。RP系統(tǒng)與全自動生化鑒定儀鑒定比較，RP系統(tǒng)用時較短且準確性較高，但成本也較高，試劑耗材較貴，每次要運行8個樣品，而且制備樣品條時純培養(yǎng)物的取樣量要掌握好，才能出現(xiàn)比較好的DNA指紋圖譜。

Bt對于農(nóng)作物防治害蟲有重大的作用，隨著科學技術(shù)水平的提高和對Bt研究的深入，新的鑒定方法會不斷涌現(xiàn)，基因分析鑒定方法也會更完善，普及范圍更廣，檢測成本更低，有利于提高鑒定效率，推動殺蟲劑相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。采用基因工程技術(shù)篩選、分離Bt菌株應(yīng)該是將來的對于Bt鑒定的主要研究方向[9]，本研究結(jié)果也為這項技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。此外，伴孢晶體形成是Bt的重要特征，在RP系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進行蛋白毒素結(jié)晶試驗，有利于提高鑒定效率。