鄧清 張鐵泉 樂(lè)問(wèn)津 黃強(qiáng) 李宓

(荊州市第一人民醫(yī)院肝膽外科，湖北 荊州 434000)

胃癌是全世界范圍內(nèi)消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其腫瘤類(lèi)型主要為腺癌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，中國(guó)男性胃癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第七位，死亡率約占所有惡性腫瘤的10%[2-3]。隨著臨床研究不斷進(jìn)展，胃癌的臨床診斷率不斷提升，但是關(guān)于晚期胃癌的治療和預(yù)后檢測(cè)仍進(jìn)展不大。因此，探討胃癌發(fā)病進(jìn)展的準(zhǔn)確分子機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)具有超過(guò)200個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA，參與不同種類(lèi)惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程[4]。對(duì)于胃癌，LncRNAH19及l(fā)ncRNAMEG3已被明確為胃癌的活性致癌基因，對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有直接的影響[5]。 據(jù)報(bào)道，目前已有多種LncRNA與腫瘤進(jìn)展途徑相關(guān)，包括PCGEM1[6]、SOCS2-AS1[7]、PlncRNA-1[8]和DRAIC[9]，都有可能成為有效的腫瘤標(biāo)志物。有學(xué)者證明lncRNA H19通過(guò)阻斷AR和E3泛素連接酶MDM2之間的相互作用來(lái)阻止AR泛素化和降解，達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。

最近的研究表明，miR-223可能在各種惡性腫瘤中起關(guān)鍵調(diào)控作用。據(jù)以前的研究，在前列腺癌中miR-223下游的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物可以直接促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡[11]。在最新的研究中指出，miR-223可以通過(guò)靶向AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)阻礙肝細(xì)胞癌的發(fā)展[12]。然而目前仍然缺乏關(guān)于miR-223功能的確切機(jī)制。為了探索長(zhǎng)鏈非編碼DRAIC和miR-223在胃癌中的功能及其相關(guān)影響，本文分析兩者在胃癌中的表達(dá)情況及生物學(xué)行為的檢測(cè)(包括細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn))，旨在為胃癌患者提供一個(gè)潛在的新的治療和預(yù)后靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞株BGC-823、AGS、HCG-27及SGC-7901細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞所，在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。DRAIC-siRNA和陰性對(duì)照(NC)購(gòu)自中國(guó)上海GenePharma生物有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000模擬物購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司；TRIrizol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；逆反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購(gòu)自日本TOYOBO公司；PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Kapa公司。選擇2016年1月～2016年12月 在本院接受胃癌切除術(shù)的患者得到新鮮的胃癌和相鄰正常組織，手術(shù)切除后立即將組織放置液氮冷凍，儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?lái)自病理科的胃癌組織均獲得了醫(yī)院保護(hù)人類(lèi)受試者委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了所有患者的知情同意書(shū)。

1.2 定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)分析 將SGC-7901細(xì)胞接種在12孔板中，生長(zhǎng)至50%融合以進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，90%用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA。在轉(zhuǎn)染后第3d，收獲細(xì)胞，并使用TRIZOL試劑提取總RNA。使用ImProm-II TM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)總RNA水平進(jìn)行qPCR分析。所有反應(yīng)用Step-One Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行，使用2-△△Ct計(jì)算法分析qPCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。DRAIC-siRNA的siRNA序列：F：(正向)5’-AATGAGGCGAGGGCTGGGGAACCTA-3’，R：和(反向)5’-TTGAGGGCGGAGGGTCGGAaatGGC-3’。miR-204，F(xiàn)：的前引物(正向)5’-AATGAGGGTGGGGGCGAGCGAAGGT-3’，R：和(反向)5’-AATGCGGATGCGGGAGGGGCGGGAGC-3’。

1.3 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 驗(yàn)證DRAIC和miR-223的相關(guān)關(guān)系使用雙熒光素酶測(cè)定，將24孔板中的DRAIC和NC細(xì)胞與0.4mg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告載體和0.08mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染，使用 siPORTneoFX(Ambion，Austin，TX)，根據(jù)使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48h制備裂解物。 使用雙光發(fā)光報(bào)告基因測(cè)定(Applied Biosystems)測(cè)量熒光素酶活性。將螢火蟲(chóng)熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化后測(cè)定海腎螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡測(cè)定 使用RIPA緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，通過(guò)配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗(濃度1:1000)一起孵育過(guò)夜。 隨后將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將胃癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度生長(zhǎng)在90%時(shí)，用200μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測(cè)量劃痕的初始距離(0 h)，在恒溫孵箱中孵育72h后，測(cè)量劃痕的距離，并計(jì)算細(xì)胞的遷移率。細(xì)胞遷移率的計(jì)算公式=[遷移距離D(0h)-遷移距離D(72h)]/ 遷移距離D(0h)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠100μl，37℃孵育20min，逐步消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按照2.5×104/ ml用無(wú)血清培養(yǎng)基將胃癌細(xì)胞稀釋?zhuān)瞥杉?xì)胞懸液；按照每孔200μl的細(xì)胞懸液加入Transwell上室；孵育24h后使用甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色15min，使用棉簽去除小室內(nèi)膜上的細(xì)胞，然后于顯微鏡下計(jì)數(shù)，觀察4個(gè)高倍視野(×40)下穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀分析 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡情況。將SGC-7901細(xì)胞以2×105/孔的濃度接種在6孔板中，分別用NC和DRAIC-siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72h后，通過(guò)FITC標(biāo)記的AnnexinV/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 DRAIC在胃癌組織、癌旁正常組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況 qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中DRAIC表達(dá)水平明顯較高[(2.12±0.28) vs (0.59±0.15)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1A；DRAIC在SGC-7901細(xì)胞株中表達(dá)水平比其他細(xì)胞株明顯增高[(1.91±0.17) vs (1.21±0.15)vs(0.77±0.13) vs (0.82±0.18)],差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見(jiàn)圖1B。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)DRAIC在胃癌中可能扮演一定的促癌作用，并挑選SGC-7901為進(jìn)一步生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

圖1 DRAIC在胃癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況Figure 1 DRAIC expression in gastric cancer tissues and cell lines注：A. DRAIC在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)情況；B. DRAIC在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，①P<0.05

2.2 DRAIC和miR-223之間的調(diào)控關(guān)系 通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站篩選與DRAIC有直接作用的miRNA分子，miR-223的3’UTR與DRAIC具有相似的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶驗(yàn)證DRAIC與miR-223的 3’UTR結(jié)合調(diào)控情況，將DRAIC與miR-223共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,DRAIC可以明顯抑制野生型miR-223-3’UTR的熒光素酶活性，但不能調(diào)控突變型miR-223-3’UTR的活性,見(jiàn)圖2，表明DRAIC能與miR-223的3’UTR特異性結(jié)合，且可調(diào)控miR-223的表達(dá)活性。

2.3 DRAIC調(diào)控胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡行為 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，DRAIC-siRNA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡速率明顯高于NC對(duì)照組的細(xì)胞凋亡比率[(16.33±2.16)% vs(10.05±1.98)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3A；抑制DRAIC的表達(dá)后阻滯于G1期細(xì)胞增多[(71.14±8.36)% vs(66.77±6.57)%]，S分裂期細(xì)胞減少[(19.92±3.15)% vs(21.94±4.21)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3B,表明抑制DRAIC的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的凋亡行為得到一定程度的促進(jìn)。

圖2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DRAIC和miR-223之間的相互關(guān)系

Figure2LuciferaseassaytodeterminethecorrelationbetweenDRAICandmiR-223

注：與突變型比較，①P<0.05

2.4 DRAIC調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 抑制DRAIC的表達(dá)后，DRAIC-siRNA組細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯少于NC組[(128.6±18.2)vs(31.5±7.6)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4A, 表明抑制DRAIC的表達(dá)在一定程度上可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 抑制DRAIC的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的遷移能力受到一定的抑制；72h后，DRAIC組細(xì)胞的遷移比率明顯低于NC組[(82.45±7.62)% vs(22.31±4.42)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4B，表明抑制DRAIC的表達(dá)在一定程度上可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 DRAIC和miR-223之間的調(diào)控關(guān)系Figure 3 The regulatory relationship between DRAIC and miR-223注：A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DRAIC對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡行為的影響;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DRAIC對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

3 討論

胃癌是全球消化系統(tǒng)死亡率第二高的惡性腫瘤，在亞洲每年大約有60%的患者被診斷為胃癌，其中中國(guó)的發(fā)病率約占全球胃癌患者總數(shù)的42%[14]。盡管目前胃癌的手術(shù)技術(shù)有所改善，且輔助治療方式不斷進(jìn)步，但是胃癌的死亡率仍居高不下，這主要是因?yàn)樵缙谖赴┰\斷困難和晚期胃癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15-16]。因此，需要提高對(duì)胃癌機(jī)制的認(rèn)識(shí)和特異性生物分子標(biāo)志物的識(shí)別，有助于胃癌的早期預(yù)測(cè)和臨床療效的改善。

據(jù)報(bào)道，LncRNA參與不同種類(lèi)的惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程[17]。在胃癌中，眾多的LncRNA與腫瘤轉(zhuǎn)移信號(hào)通路途徑相關(guān)，從而可以作為胃癌發(fā)生發(fā)展的檢測(cè)因子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LncRNA中的LINC01138和SUZ12P1可以在一定程度上促進(jìn)前列腺癌的增殖[18]。同時(shí)有研究指出，GAS5可以通過(guò)調(diào)節(jié)CCL1的表達(dá)參與膀胱移行細(xì)胞癌的侵襲行為[19]。Hotair通過(guò)結(jié)合YBX1負(fù)調(diào)節(jié)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活和增殖能力[20]。在胃癌中關(guān)于腫瘤調(diào)控因子有眾多的組織類(lèi)型差異，通過(guò)使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織樣品中DRAIC的表達(dá)顯著上調(diào)。

為了深入了解DRAIC在胃癌細(xì)胞中的更多潛在作用，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了DRAIC在胃癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況，然后檢測(cè)DRAIC對(duì)胃癌細(xì)胞株遷移和侵襲行為的具體影響。之前相關(guān)研究指出，DRAIC相關(guān)基因與翻譯延伸、蛋白質(zhì)生物合成、RNA剪接、蛋白質(zhì)結(jié)合與核糖體的結(jié)構(gòu)成分相關(guān)，主要參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、修飾依賴性蛋白質(zhì)分解代謝、蛋白結(jié)合和鋅離子結(jié)合等細(xì)胞因子行為，表明DRAIC在胃癌的發(fā)展過(guò)程中扮演核心的調(diào)控作用。

圖4DRAIC調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為
Figure4DRAICregulatesthemigrationandinvasionofgastriccancercells

注：A.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DRAIC對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響; B.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DRAIC對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SGC-7901胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力被DRAIC因子所調(diào)控，且和miR-223分子的表達(dá)相關(guān)。值得注意的是，miR-223已被報(bào)道是前列腺癌中的腫瘤調(diào)控因子，發(fā)揮一定的抑癌作用[21]。本研究中miR-223在胃癌中扮演的作用與之前前列腺癌中的報(bào)道不一致，推測(cè)可能miR-223具有一定的組織特異性，在不同類(lèi)型的腫瘤組織中表達(dá)存在差異。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，DRAIC在胃癌中的高表達(dá)和miR-223共同調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展及遷移轉(zhuǎn)移行為，這有可能成為預(yù)測(cè)胃癌進(jìn)展、預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療效果的分子標(biāo)志物。