白丹 倪菁 雷飛 嚴喜章 馬建梅

(西安醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，陜西 西安710021)

甲狀腺功能減退癥(hypothyroidism，HT)是內分泌科的常見疾?。粊喤R床甲狀腺功能減退(subclinical hypothyroidism ，SCH)是以促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平增高而甲狀腺功能正常為特征的代謝性疾病。近年來有研究表明，甲狀腺功能減退癥(HT)和亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)患者均可發(fā)生心臟舒縮功能障礙[1]。而在SCH中僅有促甲狀腺素(TSH)升高，甲狀腺素水平正常，推測TSH在心臟舒縮功能障礙發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。甲狀腺外的許多組織及細胞都存在TSH受體(TSHR)，TSH可通過與受體結合在這些組織細胞發(fā)揮病理生理作用[2]。Dong等[3]在研究中證實了原代大鼠心肌細胞表面TSHR的表達，而且發(fā)現(xiàn)高濃度長時間的TSH作用于心肌細胞表面TSHR能夠明顯下調鈣離子、serca2a、Ryr2蛋白水平，通過對PKA/PLN信號通路的調控機制，影響心臟舒縮功能。本研究旨在探討TSHR在SCH小鼠心室肌細胞上的表達情況，為亞臨床甲狀腺功能減退與心臟舒縮功能障礙的關系研究提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 SCH動物模型制備 30只7周齡BALB/c小鼠以普通飼料加蒸餾水適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組及實驗組，每組15只。對照組小鼠飲用正常水。實驗組小鼠按照Zhou 等[4]實驗建模的方法建立SCH動物模型，具體操作：每日以0.1% 丙硫氧嘧啶(PTU)溶液替代飲水，6周之后，腹腔注射4-苯基丁酸[100mg/(kg·d)](一種經典抑制內質網應激的化學分子伴侶，可改善SCH模型小鼠中TSH介導的內質網應激反應)，注射28天后完成SCH動物模型的制備。對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2 超聲心動圖檢測 實驗進行當日各組均經腹腔注射氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉小鼠后，采用超高分辨率多普勒超聲診斷儀(Visual Sonics Vevo 2100型，Canada)及相關分析軟件進行超聲心動圖檢查，測量數(shù)據包括：脈沖多普勒二尖瓣E峰與組織多普勒二尖瓣環(huán)E’峰之比值(E/E’)、左室射血分數(shù)(LVEF)。

1.3 血清TT3、TT4、TSH水平測定 各組小鼠摘取眼球取血，離心后采集血清，-80℃保存待測。放射免疫分析法檢測血清中總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平。操作嚴格按照試劑盒說明書進行(TT3、TT4、TSH放射免疫分析試劑盒均購于天津市九鼎醫(yī)學生物工程有限公司)，抗體及試劑混勻后37℃溫育1h，加入分離劑后充分搖勻，室溫放置15min。離心前任取兩管測量，作為總放射性強度T，3500r/min，留沉淀物測量讀數(shù)。

1.4 小鼠心室組織TSHR免疫組織化學染色 各組小鼠開胸取出心臟，剪取心室組織，4%多聚甲醛，4℃固定24h。常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片(切片厚度5μm)，貼附于載玻片上，經脫蠟、脫水、抗原修復、過氧化氫消除內源性過氧化物酶等步驟后，使用TSHR抗體顯色試劑盒(購于武漢博士德生物工程有限公司，一抗為兔抗小鼠TSHR多克隆抗體)，加入后4°C過夜，洗滌后再加入二抗，37℃孵育1h，洗滌；加入顯色液。按步驟進行染色后，光鏡下觀察染色結果。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

2 結果

2.1 兩組超聲心動圖檢測結果 實驗組E/E’值高于對照組(P<0.01)；兩組LVEF比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組超聲心動圖檢測結果比較Table 1 Echocardiography results in the groups

2.2 兩組血清TT3、TT4、TSH水平 兩組TT3水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗組血清TT4水平低于對照組;血清TSH水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表2。提示實驗組小鼠造模成功。

表2 各組血清TT3、TT4、TSH水平比較Table 2 TT3, TT4 and TSH serum levels in the groups

2.3 兩組小鼠心室肌細胞TSHR免疫組織化學染色情況 光鏡下觀察各組小鼠心室肌細胞TSHR免疫組織化學染色情況，可見陽性染色為棕黃色顆粒。實驗組TSHR表達明顯高于對照組，見圖1。

3 討論

眾多研究表明甲狀腺功能減退可導致多種心臟疾病的發(fā)生。甲狀腺功能減退即甲狀腺素的合成或分泌減少或者是分泌的甲狀腺素生物效價降低[5-6]，而甲狀腺素可以通過影響心肌組織細胞內的鈉-鉀-ATP 酶的活性及影響HMG-CoA 還原酶(HMGCR)的合成從而使甘油三酯的清除率下降等一系列機制從而引起心臟傳導功能異常誘發(fā)心律失?；蛘呒又毓跔顒用}粥樣硬化，增加冠心病的患病率；還可以通過調節(jié)蛋白合成的變化來影響心肌肌凝蛋白ATP 酶的活性和功能，從而直接影響心肌收縮力和心排血量，導致冠脈痙攣、心肌缺血等[7-9]。

圖1 各組小鼠心室肌細胞TSHR免疫組織化學染色結果(×200)Figure 1 Results of TSHR immunohisto-chemical staining in ventricular myocytes of micein each group注：A. 陰性對照組；B. 對照組；C.實驗組

除了甲狀腺功能減退引起心臟舒縮功能改變外，近年來關于亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)對心血管系統(tǒng)的危害也逐漸被人們所認識。在出現(xiàn)SCH時，心臟前負荷顯著減低，后負荷增加，心輸出量及每搏輸出量減少，影響左室舒張功能、損傷血管內皮功能、增加C反應蛋白(CRP)水平，從而增加冠心病和心力衰竭發(fā)生的風險[10-12]。近幾年國內外學者對高水平TSH與心臟功能之間相關性進行了大量研究，高水平的TSH可嚴重影響肥厚性心肌病患者左心室的舒張功能[13-16]。研究表明在充血性心力衰竭患者中SCH和心衰的發(fā)生呈正相關，但在正常人群中則無[16]。除此之外，也有研究表明老年女性動脈粥樣硬化和心肌梗死的發(fā)生與SCH有關[17]。

HT和SCH患者均可發(fā)生心臟舒縮功能障礙，而在SCH中僅有TSH水平升高，甲狀腺素水平正常，提示亞甲減時升高的血清TSH對心臟的舒縮功能改變有一定的影響。甲狀腺外的許多組織及細胞都存在TSH受體，TSH可通過與受體結合在這些組織細胞發(fā)揮病理生理作用。已有研究證實TSH受體存在于血管內皮細胞和平滑肌細胞，并發(fā)揮一定作用。TSH可通過直接作用于內皮細胞促進內皮素、纖溶酶原激活物抑制物-1等的分泌，作用于平滑肌細胞促進平滑肌細胞發(fā)生表型轉換從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[19-20]。大量實驗研究表明TSH受體存在于眶后成纖維細胞[21]，但對于TSHR是否也存在于心肌細胞的相關研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，經過亞臨床甲狀腺功能減退造模的實驗組小鼠，超聲心動圖檢測結果提示實驗組小鼠心功能受損。實驗組血清TT4水平明顯低于對照組，血清TSH水平明顯高于對照組(P<0.01)，提示實驗組小鼠造模成功。本研究應用免疫組織化學染色法結果提示心室肌組織中存在一定的TSHR表達，當亞甲減發(fā)生時，心室肌組織中的TSHR表達上調。黃雯[22]在相關研究中探討了心室肌TSHR表達上調的具體機制及功能，通過體內、外試驗證實TSH可通過cAMP/PKA/CREB信號通路上調心室HMGCR，并在一定程度上促進心室肌TSHR的表達、上調心室肌細胞分泌BNP，在甲減相關性心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而目前對SCH的研究報道中普遍發(fā)現(xiàn)TSH受體功能缺失或者等位基因失活性突變是引起SCH的主要原因。但是結合本文實驗研究推測：是否可能存在其他的作用機制，即在SCH患者中，TSH的增加所導致的TSH受體的增加不僅可能存在受體功能缺失型變異，也有可能是受體密度或數(shù)量的增加，高濃度的TSH與心肌組織中增加的TSH受體結合從而影響心臟的功能。因此，對增加的TSH受體活性的測定以及結合后如何影響心肌組織的作用機制方面將是我們進一步研究和探索的方向。

4 結論

當發(fā)生亞臨床甲狀腺功能減退時，高濃度的TSH可通過與心室肌組織中高表達的TSHR結合并影響心臟舒縮功能。