吳曉青，陳曉珍,劉睿穎,任瑤瑤,蔣合眾,譚 睿*

1西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，是著名的生熟異治中藥，有生首烏和制首烏之分。生品性平，味甘、苦；歸心、肝、大腸經(jīng)；制品性變溫、味轉(zhuǎn)甘，歸肝、腎經(jīng)。功善補(bǔ)益精血，固腎烏須。骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少，骨脆性增加以及骨折危險(xiǎn)性增高為特征的骨代謝性疾病。原發(fā)性O(shè)P是絕經(jīng)后老年婦女的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著世界人口老齡化的發(fā)展，老年性O(shè)P發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，WHO已將其列為三大老年性疾病之一。

目前臨床上用于治療OP的藥物主要有鈣劑、雌激素、維生素D、降鈣素類、雙磷酸鹽類等，雖然臨床上具有一定的療效，但不良反應(yīng)較多。中藥治療骨質(zhì)疏松癥日益受到青睞，但其肝毒性也已引起重視。有些療效確切、臨床用藥廣、關(guān)注度高的知名中藥如壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊(《2012版中國(guó)國(guó)家基本藥物目錄》在列唯一補(bǔ)腎壯骨中成藥)等有肝臟不良反應(yīng)，且均已在《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》公開(kāi)，這對(duì)臨床安全、合理用藥帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。前期我們發(fā)現(xiàn)，制首烏無(wú)毒[2]。已有研究報(bào)道，制何首烏含藥血清能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[1]，大黃素能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞方向分化，抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞方向分化[3]。二苯乙烯苷能促進(jìn)BMSCs堿性磷酸酶表達(dá)，刺激骨鈣素分泌，上調(diào)Collal和Runx2 mRNA的表達(dá)，增加Wnt信號(hào)通路核心蛋白(β-catenin ) mRNA和蛋白的表達(dá)[4]。生、制首烏正己烷提取物對(duì)維甲酸誘發(fā)的骨質(zhì)疏松是否有作用，未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)、骨密度、骨顯微結(jié)構(gòu)等探討生、制首烏正己烷提取物對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松癥的藥效作用，為生、制首烏正己烷提取物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

1.1.1 生、制首烏正己烷提取物的制備

稱取生或制首烏粉末100 g，加入500 mL無(wú)水乙醇，超聲波振蕩提取1 h,過(guò)濾，重復(fù)提取二次，合并提取液，減壓回收溶劑至干，加入150 mL蒸餾水懸浮，用正己烷200 mL×3 萃取，合并萃取液，減壓濃縮至干，浸膏用作抗骨質(zhì)疏松藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物

生、制首烏正己烷提取物。用0.5%羧甲基纖維素水溶液制成混懸，備用;尼爾雌醇片,北京四環(huán)制藥有限公司公司生產(chǎn)；維甲酸(retinoic acid,RA)，重慶華邦生化制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠，雌雄各半，開(kāi)始試驗(yàn)體重32～34 g,購(gòu)于四川省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SCXK[川] 2008-14，每天接受12 h光照/12 h黑暗，光照周期為8∶00～20∶00，實(shí)驗(yàn)室溫度20±2 ℃，濕度60%，動(dòng)物可以自行攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔用水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。小鼠適性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及給藥方案

取昆明種小鼠，SPF級(jí)，180只隨機(jī)分組為正常對(duì)照組、模型組(維甲酸105 mg·kg-1)，陽(yáng)性對(duì)照組(尼爾雌醇2 mg·kg-1)，生首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，清蒸制首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，黑豆制何首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，每組20只，除正常對(duì)照組于每日上午灌胃生理鹽水外，其它各組均于每日上午灌服維甲酸105 mg·kg-1,連續(xù)灌胃14 d，在造模的同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組及生、制首烏各劑量組給予不同濃度的受試藥，給藥期間隔天稱量體重以調(diào)整給藥量，停藥次日，小鼠摘眼球取血，取股骨。

1.4 血清生化及相關(guān)激素檢測(cè)

血清鈣，ALP，TRAP檢測(cè)均按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，血清BGP，E2的含量用放免法測(cè)定。

1.5 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)

取股骨用10%的福爾馬林固定。常規(guī)石臘包埋，切片，HE染色，光鏡觀察骨組織形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組血鈣水平下降，用藥后血清鈣水平升高，生首烏各劑量組與模型組比較無(wú)顯著性差異，制首烏各劑量組顯著升高(P<0.05)。模型組s-ALP,s-TRAP顯著升高(P<0.05)，生、制首烏各劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見(jiàn)表1)。

2.2 對(duì)骨代謝相關(guān)激素水平的影響

模型組小鼠s-BGP水平顯著高于正常組(P<0.05)。生、制首烏各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常組比較，模型組s-E2水平下降，生、制首烏各劑量組使體內(nèi)s-E2顯著上升(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

2.3 病理學(xué)形態(tài)觀察

從常規(guī)病理切片來(lái)看，正常組骨皮質(zhì)完整，較厚，骨髓腔內(nèi)容物多，骨小梁大小粗細(xì)均勻，骨髓數(shù)量較多；模型組皮質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少較為稀疏，細(xì)少，骨髓數(shù)量減少。各治療組與模型組比較，骨組織形態(tài)均有不同程度的改善，其中豆制首烏高、低劑量組骨皮質(zhì)顯著增厚，骨骺生長(zhǎng)較活躍，骨小梁較為粗大，相互連接，排列整齊；陽(yáng)性藥組與模型組比較，骨皮質(zhì)亦有增厚，骨小梁數(shù)量多且連接良好。

表1 生、制首烏對(duì)血液生化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of Raw and Processed Polygoni Multiflori on Blood Biochemical

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對(duì)照組比較3)P<0.01，
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01

表2 生、制首烏對(duì)骨代謝相關(guān)激素水平的影響Table 2 Effects of raw and Processed Polygoni multiflori on hormones related to bone

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對(duì)照組比較3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

2.4 骨組織靜態(tài)計(jì)量學(xué)觀察

骨組織靜態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)觀察表明，模型組小鼠發(fā)生了骨質(zhì)疏松改變，表現(xiàn)在骨小梁數(shù)量及形態(tài)變化，骨小梁數(shù)量比正常組減少約50%，MTPT(平均骨小梁寬度)明顯變窄(P<0.01)，MBCT(平均骨皮質(zhì)厚度)明顯變薄(P<0.01)。經(jīng)各給藥組治療后，與模型組比較，上述指標(biāo)都出現(xiàn)了明顯改善，骨小梁數(shù)明顯增加(見(jiàn)表3)。

3 討論

維甲酸是維生素A的衍生物，臨床上主要用于腫瘤的化療和皮膚病的治療，大劑量服用會(huì)引發(fā)骨密度降低和骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而造成骨質(zhì)疏松。該反應(yīng)與雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松極為相似，因此常被用作小鼠急性骨質(zhì)疏松的造模方法[5]。骨代謝指標(biāo)具有創(chuàng)傷小、快速靈敏的特點(diǎn)，對(duì)評(píng)價(jià)骨的狀態(tài)有重要意義。血清堿性磷酸酶(s-ALP)可以部份反映成骨細(xì)胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶(s-TRAP)是反應(yīng)骨吸收的特征性酶[6]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠s-ALP,s-TRAP顯著升高(P<0.05)，生、制首烏各劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果表明維甲酸可造成高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。生、制首烏正己烷提取物可顯著降低小鼠血清ALP和TRAP的水平，提示生、制首烏正己烷提取物可抑制骨吸，減小骨丟失。BGP是成骨細(xì)胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，是反應(yīng)骨更新情況的一項(xiàng)特異性指標(biāo)[7]。生、制首烏各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可以看出，模型組小鼠發(fā)生了骨質(zhì)疏松改變，骨小梁數(shù)量及形態(tài)變化，骨小梁數(shù)量比正常組減少約50%，這一現(xiàn)象與臨床上骨質(zhì)疏松樣癥狀相符[8，9]，經(jīng)各給藥組治療后，上述指標(biāo)都出現(xiàn)了明顯改善。

圖1 骨組織病理切片 Fig.1 Bone tissue biopsy注：A 正常組；B 模型組;C 陽(yáng)性組;D 生首烏高劑量組;E 生首烏中劑量組;F 清蒸制高劑量組;G 清蒸制中劑量組;H 黑豆制高劑量組;I 黑豆制中劑量組 Note: A Normal group；B Model group；C Positive group；D Raw radix polygoni multiflori high dose group；E Raw radix polygoni multiflori middle dose group；F Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；G Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；H Black soya bean high dose group；I Black soya bean middle dose group

表3 生、制首烏對(duì)骨組織靜態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of raw and Processed Polygoni Multiflori Recipe on Static Metrology Indexes of Bone

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對(duì)照組比較3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

中醫(yī)理論認(rèn)為“肝腎同源，乙癸同源，精血同源” 骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育和修復(fù)有依賴于精血的營(yíng)養(yǎng)滋潤(rùn)，肝腎虧虛則精血無(wú)源，無(wú)以生精養(yǎng)骨，髓枯筋痰，發(fā)為骨屢。發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的主要原因是年老體弱、腎氣不足、腎陽(yáng)虛和腎陰虛、筋骨失養(yǎng)、經(jīng)絡(luò)不通、氣血疲阻，屬本虛標(biāo)實(shí)之疾。制首烏，補(bǔ)肝腎，藥用價(jià)值極高。制首烏正己烷提取物能升高維甲酸所致骨質(zhì)疏松癥小鼠的的骨密度，同時(shí)能有效改善骨小梁微結(jié)構(gòu)退化的現(xiàn)象，有效抑制維甲酸所致骨質(zhì)疏松癥小鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，增加鈣吸收率，降低骨吸收，能有效地預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥，生、制首烏提取物對(duì)維甲酸致小鼠骨質(zhì)疏松的治療作用，其機(jī)制可能與減緩雌激素水平降低，抑制骨高轉(zhuǎn)換有關(guān)，但制首烏臨床使用毒性遠(yuǎn)小于生首烏，因此可作為治療骨質(zhì)疏松的有效藥物之一。