尚瀟瀟，朱 琳，羅孝菁，饒 毅，唐 祥，張程瑞，蒲 祥

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，雅安 625014

喜樹(shù)(Camptothecaacuminata)，為我國(guó)特有二級(jí)野生保護(hù)植物，主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域及西南各省[1]。1966年由Wall等首次從樹(shù)皮中分離獲得喜樹(shù)堿(Camptothecin)[2]，其衍生物伊立替康、拓?fù)涮婵迪嗬^被開(kāi)發(fā)用于多種實(shí)體瘤如結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性淋巴瘤等的臨床治療[3]，已成為抗腫瘤藥物市場(chǎng)上的主要品種之一，具有較大市場(chǎng)銷售額。喜樹(shù)因全株含有喜樹(shù)堿及喜樹(shù)堿類似物而受到持續(xù)關(guān)注，現(xiàn)已成為市場(chǎng)上喜樹(shù)堿及其衍生物產(chǎn)品獲取的主要植物資源之一[3]。此外，喜樹(shù)富含多種代謝產(chǎn)物，研究人員先后從喜樹(shù)的葉、果實(shí)、根、樹(shù)皮中發(fā)現(xiàn)了一百余種化合物，其中包括喜樹(shù)堿在內(nèi)的喹啉類生物堿以及吲哚類生物堿四十余種[4-7]，然而與日俱增的市場(chǎng)需求導(dǎo)致喜樹(shù)資源遭到破壞。

要實(shí)現(xiàn)喜樹(shù)資源的充分利用和探明代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化規(guī)律，均需要對(duì)喜樹(shù)進(jìn)行代謝產(chǎn)物輪廓分析。以甲基橙為顯色劑，楊磊等[8]構(gòu)建了喜樹(shù)中總生物堿的萃取光度法。余響華等[9]應(yīng)用乙醇浸提法優(yōu)化喜樹(shù)果中生物堿提取工藝。Montoro 等[10]以70%乙醇作溶劑對(duì)溫室培養(yǎng)喜樹(shù)葉進(jìn)行代謝指紋分析，并從中鑒別了24種成分。在代謝組學(xué)分析中，提取溶劑和提取方法的選擇尤為重要。喜樹(shù)葉中代謝產(chǎn)物豐富，目前未見(jiàn)葉中總生物堿提取工藝優(yōu)化及抗菌抗氧化活性報(bào)道。由此我們以葉為研究對(duì)象，采用超聲冷提技術(shù)與響應(yīng)面分析法結(jié)合[11]，對(duì)喜樹(shù)葉中的總生物堿成分進(jìn)行提取工藝優(yōu)化及抗菌、抗氧化活性測(cè)試，為進(jìn)一步從喜樹(shù)葉中發(fā)掘活性生物堿奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

喜樹(shù)葉(樹(shù)體外圍新梢，枝頂端1～6位葉)取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)，樹(shù)齡：大于十年，采集時(shí)間：2017年4月，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)楊瑞武教授鑒定為喜樹(shù)鮮葉(Camptothecaacuminataleaf)。喜樹(shù)堿對(duì)照品(上海阿拉丁試劑有限公司，中國(guó))、2，2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS，C18H24N6O6S4)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，C18H12N5O6)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，C18H12N6)、丁基羥基茴香醚(BHA，C11H16O2)、抗壞血酸(Vc，C6H5O6)均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；色譜純甲醇和乙腈(TEDIA，美國(guó))；無(wú)水乙醇、甲醇、甲酸、三氯甲烷、甲基橙、石油醚、二甲亞砜均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠； 0.22 μm和 0.45 μm針頭式過(guò)濾器(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó))；無(wú)菌注射器(上海聚民生物科技有限公司，中國(guó))；硫酸卡那霉素(生工生物工程(上海)股份有限公司，中國(guó))； 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC(Agilent，美國(guó))；Specord200Plus紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Analytik Jena，德國(guó))；BT124S電子天平(Sartorius，德國(guó))；SB-5200 DTD 臺(tái)式超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國(guó))；DHG-9101 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；PHS-3C 型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國(guó))；IMS-50 型制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司，中國(guó))；高壓蒸汽滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司，中國(guó))；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(上海博訊醫(yī)療設(shè)備，中國(guó))；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城，中國(guó))；移液槍(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的前處理與提取

將新采集的喜樹(shù)葉鮮樣置于恒溫干燥箱25 ℃烘至恒重，粉碎過(guò)篩，即為喜樹(shù)葉干樣。干樣用石油醚浸泡脫色，烘干后樣品袋封裝-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｏ矘?shù)葉樣品粉末0.50 g，加入適量提取溶劑后，超聲冷提(0 ℃)，提取液4 000 rpm離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入樣品瓶，并用提取溶劑定容至5 mL備用，得樣品液。

2.2 溶液配置

對(duì)照品溶液I：稱取喜樹(shù)堿對(duì)照品3.0 mg 于5 mL 容量瓶中，用適量DMSO溶解后乙醇定容，搖勻，配成0.6 mg/mL母液備用。檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液(pH 5)與1.5 mM甲基橙緩沖混合溶液的配置參照楊磊等[8]。

2.3 喜樹(shù)葉中總生物堿含量測(cè)定

總生物堿含量測(cè)定采用甲基橙顯色法[8]，以對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)、吸光度Y為縱坐標(biāo)線性擬合，得回歸方程Y= 3.711 9X+0.036 1(R2= 0.992 5)?？偵飰A含量(mg/g)=樣品液中總生物堿濃度(mg/mL)×樣品液體積/喜樹(shù)葉干樣質(zhì)量(g)。

2.4 喜樹(shù)堿含量測(cè)定

對(duì)照品溶液II：將喜樹(shù)堿對(duì)照品母液I稀釋十倍，即得濃度為60 μg/mL喜樹(shù)堿對(duì)照品溶液II。喜樹(shù)堿含量測(cè)定使用Agilent 1260 Infinity高效液相色譜，色譜條件：色譜柱(InertSustain C18，4.6×250 mm，5 μm分離，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。流動(dòng)相組成A：水+0.1%甲酸，B：甲醇；梯度洗脫程序：0～12 min，5%～50%(B)，12～30 min，50%～80%(B)，30～39 min，80%～98%(B)，39～45 min，98%～98%(B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，373 nm。自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，喜樹(shù)堿進(jìn)樣量分別為60、300、600、3 000、6 000 ng，以喜樹(shù)堿進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，色譜峰積分面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 3.73 861X+70.080 71 (R2=0.999 7)。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以喜樹(shù)葉生物堿含量為指標(biāo)，考察提取溶劑(甲醇：甲酸：水(甲醇比例)=12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1；甲醇：氯仿=4∶1、2∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4；乙腈：水=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，固定料液比1∶10，提取時(shí)間30 min，超聲功率255 W)、提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min，固定料液比1∶10，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4，超聲功率255 W)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定提取時(shí)間30 min，超聲功率255 W，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)、超聲功率(120、165、210、255、297 W，固定提取時(shí)間30 min，料液比1∶10，提取溶劑甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)以及甲醇比例(6∶1∶13、9∶1∶10、12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1，固定提取時(shí)間30 min，超聲功率255 W，料液比1∶10)5個(gè)因素對(duì)總生物堿含量的影響。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲功率、甲醇比例為自變量，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。用Design Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后通過(guò)模型驗(yàn)證得出總生物堿超聲冷提最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2.7 抑菌活性測(cè)試

參照藥品微生物測(cè)試方法[12]，用二倍稀釋法將樣品配制成一定濃度梯度1.0 mL樣品，選取硫酸卡那霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，M17.5F1W1.5溶液為陰性對(duì)照，每組平行測(cè)定3次。

2.8 抗氧化活性測(cè)定

2.8.1 總抗氧化能力的測(cè)定(FRAP法)

參照Benzie建立的方法，并稍作修改[13]。以M17.5F1W1.5溶液為空白對(duì)照，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，每組平行測(cè)定3次。以0.2～1.6 mmol/L的FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的量表示[14]。

2.8.2 DPPH自由基清除活性

參照Brand-Williams建立的方法，并稍作修改[14]。以M17.5F1W1.5溶液為空白對(duì)照，BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，每組平行測(cè)定3次。清除率(RSA)計(jì)算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替樣品測(cè)得的吸光度；A1—樣品、BHA或Vc的吸光度

2.8.3 ABTS自由基清除活性

參照Re建立的方法，并稍作修改[15]。以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，每組平行測(cè)定3次。清除率(RSA)計(jì)算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替樣品測(cè)得的吸光度；A1—樣品、BHA或Vc的吸光度

2.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溶劑考察

以甲基橙法評(píng)估三種不同溶劑體系提取總生物堿收率，結(jié)果如圖1，MC體系收率最高，且隨溶劑比例變化影響顯著，MC比例為1∶1時(shí)(v/v)，總生物堿收率最高可達(dá)1.84±0.11 mg/g，但存在有色物質(zhì)干擾；MFW體系收率較為穩(wěn)定，保持在0.47±0.27 mg/g水平；AW體系溶劑比例顯著影響總生物堿收率，AW比例為3∶1(v/v)時(shí)收率最高0.50±0.01 mg/g。隨后對(duì)M1C1、M15F1W4、A3W1三種溶劑提取樣品進(jìn)行HPLC對(duì)比分析，373 nm波長(zhǎng)檢出色譜峰數(shù)M15F1W4(30個(gè))>A3W1(25個(gè))>M1C1(17個(gè))，色譜峰強(qiáng)度M15F1W4>A3W1>M1C1，喜樹(shù)堿提取量M15F1W4>A3W1>M1C1，喜樹(shù)堿色譜峰面積占比A3W1(9.99%)> M1C1 (8.48%)>M15F1W4(7.28%)。由此可知，M15F1W4體系提取總生物堿種類更為豐富，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用MFW作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)總生物堿提取率的影響Fig.1 The yield of total alkaloids extracted with different extraction solvents

3.1.2 料液比考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A所示，總生物堿提取率隨溶劑用量增加逐漸增大，影響顯著，料液比達(dá)1∶20時(shí)，提取率最高可達(dá)0.88±0.03 mg/g，但繼續(xù)增加至1∶25時(shí)，總生物堿提取率略微下降。因此選擇1∶15、1∶20、1∶25進(jìn)行響應(yīng)面分析。

3.1.3 超聲時(shí)間考察

如圖2B，總生物堿提取率隨超聲時(shí)間增長(zhǎng)逐漸升高，10～40 min時(shí)，總生物堿提取率由0.43±0.03 mg/g升至0.71±0.02 mg/g，但超聲時(shí)間至20 min時(shí)，儀器開(kāi)始產(chǎn)熱，增長(zhǎng)至50 min時(shí)，超聲產(chǎn)熱嚴(yán)重，可能會(huì)破壞部分生物堿結(jié)構(gòu)，因此后續(xù)試驗(yàn)超聲時(shí)間設(shè)定為40 min，并結(jié)合使用冰浴持續(xù)控溫。

3.1.4 超聲功率考察

結(jié)果如圖2C，超聲功率在一定程度影響總生物堿收率，總生物堿收率隨超聲功率升高而增高，升至255 W后達(dá)到最高值0.68±0.02 mg/g，繼續(xù)增加超聲功率，總生物堿收率不再繼續(xù)增加，可能樣品中生物堿已基本溶出，因此選擇210、255、297 W進(jìn)行響應(yīng)面分析。

3.1.5 甲醇比例考察

結(jié)果如圖2D，MFW溶劑體系里甲醇比例對(duì)總生物堿收率存在影響，甲醇比例由30%升至75%時(shí)，生物堿收率逐漸上升，繼續(xù)升高甲醇比例，生物堿收率略微下降，可能跟葉中生物堿極性有關(guān)，甲醇比例為75%(M15F1W4)時(shí)，總生物堿收率為0.49±0.03 mg/g，因此，選擇甲醇比例為60%(12∶1∶7)，75%(15∶1∶4)，90%(18∶1∶1)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖2 料液比(A) 、超聲時(shí)間(B) 、超聲功率(C)、甲醇比例(D)對(duì)總生物堿提取收率的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio(A),ultrasonic time(B),ultrasonic power(C),methanol ratio(D) on the yield of total alkaloids

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)二次回歸組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以喜樹(shù)總生物堿含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)料液比(A)、超聲功率(B)、甲醇比例(C)三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)(見(jiàn)表2)，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到喜樹(shù)葉總生物堿提取量對(duì)料液比(A)、超聲功率(B)、甲醇比例(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=1.62-0.091A+0.020B+0.28C+0.15AB-0.12AC-0.067BC-0.34A2-0.17B2-0.19C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

3.2.2 回歸模型方差分析與顯著性檢驗(yàn)

回歸模型方差分析使用Design-Expert 8.0，以確定三種因素對(duì)喜樹(shù)葉總生物堿提取率的影響程度和檢驗(yàn)回歸方程有效性(見(jiàn)表3)。一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)喜樹(shù)總生物堿提取率的影響顯著，各因素與總生物堿提取率呈較明顯的二次拋物線關(guān)系，表明回歸方程擬合性較好，同時(shí)表明各交互因素在響應(yīng)值(總生物堿含量)存在最大值。分析方程方差可知，由總模型P<0.000 1可知本實(shí)驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)為0.050 4>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 7，模型擬合度較好，此模型可在一定范圍內(nèi)用于分析和預(yù)測(cè)超聲輔助提取喜樹(shù)葉中總生物堿的效果。各因素影響大小順序?yàn)椋杭状急壤?C)>超聲功率(A)>料液比(B)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3(Continued Tab.3)

方差源Source平方和Sum of squares自由度Df均方和Mean squareF值F valueP值P value顯著性SignificanceBC0.01810.0187.040.0328?A^20.5010.50197.42< 0.0001??B^20.1210.1245.430.0003??C^20.1610.1663.15< 0.0001??殘差Residual0.01872.533E-003---失擬項(xiàng)Lack of Fit0.01534.913E-0036.560.0504-純誤差Pure Error2.996E-00347.491E-004---總體Cor Total1.7216----

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.001)。
Note:*represented significant difference(P<0.05),**represented extremely significant difference(P<0.001).

3.2.3 交互作用分析

圖3A-B 顯示了超聲功率與料液比對(duì)喜樹(shù)中總生物堿提取量的交互作用，等高線呈橢圓形，且交互曲面陡峭，說(shuō)明交互作用顯著，響應(yīng)值隨著超聲功率和料液比的改變先上升，后略微下降，存在最大值。圖3A-C 顯示了甲醇比例與超聲功率對(duì)喜樹(shù)中總生物堿提取量的交互作用，等高線呈橢圓形，甲醇比例與超聲功率之間的交互作用較為顯著。圖3B-C 顯示了甲醇比例與料液比對(duì)喜樹(shù)中總生物堿提取量的交互作用，等高線橢圓形，故甲醇比例與料液比之間的交互作用較為顯著。交互作用分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖3 各交互作用對(duì)總生物堿影響的響應(yīng)曲面(A-B、A-C、B-C)Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total alkaloids(A-B、A-C、B-C)

3.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design Expert 8.0軟件分析，得出喜樹(shù)葉中總生物堿提取的理論最優(yōu)條件為：超聲功率為239.25 W，甲醇：甲酸：水為17.64∶1∶1.36，料液比為1∶22.3 g/mL?？紤]到可操作性，將試驗(yàn)條件修正為：超聲功率240 W，甲醇：甲酸：水為17.5∶1∶1.5，料液比為1∶22 g /mL，所得提取總生物堿的平均含量為1.67±0.08 mg/g(n=5)，與預(yù)測(cè)值1.75 mg/g 接近，相對(duì)誤差4.57%，表明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

3.3 抑菌活性

抑菌活性測(cè)試表明，使用最優(yōu)條件提取制備的喜樹(shù)葉總生物堿提取物(LAE)對(duì)S.aureus、E.coli和P.aeruginosa具有抑菌效果，MIC值分別為4.38、8.75、8.75 μg/mL，對(duì)B.subtilis無(wú)明顯抑制效果，陰性對(duì)照MFW溶劑無(wú)抑菌活性，陽(yáng)性對(duì)照卡那霉素抑菌活性強(qiáng)，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 總生物堿提取物對(duì)四種菌的最小抑制濃度(MIC),n=3Table 4 MIC of leaf total alkaloid extract(μg/mL),n=3

3.4 抗氧化活性測(cè)試

抗氧化活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。LAE的質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時(shí)，其FRAP值為5.062 ± 0.223 mM，而質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 的BHA和Vc總抗氧化能力相近，其FRAP值分別為0.16 ± 0.01 mmol·L-1、0.16 ± 0.01 mmol·L-1。LAE、BHA、Vc對(duì)DPPH和ABTS自由基清除能力以半抑制濃度IC50表示，BHA與Vc對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力基本相當(dāng)，而LAE對(duì)兩種自由基的清除能力比BHA和Vc強(qiáng)。

表5 總生物堿提取物抗氧化活性測(cè)試(μg/mL)，n=3Table 5 Antioxidant capability of the LAE(μg/mL),n=3

4 結(jié)論

自從喜樹(shù)中發(fā)現(xiàn)喜樹(shù)堿以來(lái)，人們長(zhǎng)期致力于從喜樹(shù)中發(fā)掘新的喜樹(shù)堿類抗腫瘤活性成分，而忽視了對(duì)喜樹(shù)中其它生物堿類成分的開(kāi)發(fā)與利用。本文以喜樹(shù)葉為對(duì)象首次開(kāi)展超聲波冷提總生物堿，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝為超聲功率240 W，甲醇：甲酸：水為17.5∶1∶1.5，料液比1∶22 g /mL，總生物堿的提取率為1.67±0.08 mg/g 。該法簡(jiǎn)便易行，實(shí)用性較高，用途較廣。低溫提取確保了提取樣品中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的完整性，響應(yīng)面優(yōu)化確保了提取樣品中生物堿類成分的多樣性?？咕鷾y(cè)試結(jié)果表明LAE具有較好的抑菌活性，對(duì)S.aureus、E.coli和P.aeruginosa三種菌株的MIC值分別為4.38、8.75、8.75 μg/mL。同時(shí)，LAE呈現(xiàn)優(yōu)于BHA和Vc的抗氧化活性，其FRAP值為0.16±0.01 mmol·L-1，對(duì) DPPH和ABTS自由基清除半抑制濃度分別為4 μg/mL和3 μg/mL。本研究為喜樹(shù)葉中總生物堿的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。