張麗麗，武怡瓊，楊正飛，郭 麗，魏佳平，闞云超

(1.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院,河南 信陽464000; 2.南陽師范學(xué)院/河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽 473061)

斜紋夜蛾(Spodopteralitura)屬鱗翅目夜蛾科，為全球熱帶和亞熱帶主要農(nóng)業(yè)害蟲，國內(nèi)以華南、華東地區(qū)發(fā)生為重。斜紋夜蛾以幼蟲咬食葉片及葉柄，是一種間歇性猖獗發(fā)生的害蟲[1]。隨著近年溫室效應(yīng)導(dǎo)致氣候持續(xù)變暖以及種植業(yè)結(jié)構(gòu)變化、蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大，斜紋夜蛾發(fā)生危害逐年加重，已成為農(nóng)作物重要害蟲之一[2]。

保幼激素(Juvenile hormone,JH)是昆蟲后腦兩側(cè)咽側(cè)體合成分泌的一種萜烯類化合物[1]。JH在不同齡期昆蟲的血淋巴中通過滴度的變化(合成與代謝)調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育，其代謝通過保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)、保幼激素環(huán)氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素二醇激酶(Juvenile hormone diol kinase,JHDK)3種特異性酶催化完成[3-5]。JHEH屬于mEH家族，與組織中的膜結(jié)合，催化血淋巴中JH和保幼激素酸(Juvenile hormone acid,JHa)不可逆地轉(zhuǎn)化為保幼激素二醇(Juvenile hormone diol,JHd)和保幼激素酸二醇(Juvenile hormone acid diol,JHad)并中斷咽側(cè)體JH合成[3]。

JHEH基因首先從煙草天蛾(Manducasexta)中分離得到[6]，之后在鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾(Trichoplusiani)[7]、家蠶(Bombyxmori)[8]、谷食夜蛾(Helicoverpazea)[9]、棉鈴蟲(H.armigera)[10]等中分別克隆了JHEH基因，其表達(dá)存在差異。粉紋夜蛾和煙草天蛾JHEH基因主要在卵中特異表達(dá)[6-7]；谷食夜蛾JHEH基因主要在卵巢中表達(dá)[9]；而家蠶的脂肪體、中腸等幾乎所有組織中都有JHEH基因表達(dá)[11-12]。Zhou等[13]解析了BmJHEH的晶體結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)是一個典型的α/β水解酶二聚體，N末端的XWG氨基酸結(jié)合細(xì)胞膜，與亞細(xì)胞定位有關(guān)。序列分析發(fā)現(xiàn)，其功能區(qū)氨基酸殘基都非常保守，有一個較深的疏水口袋結(jié)合JH，其中2個酪氨酸殘基Tyr298、Tyr373和HGWP花樣結(jié)構(gòu)組成陰氧離子洞，催化三聯(lián)體Asp227、Glu403、His430氨基酸殘基高度保守。半翅目綠盲蝽(Apolyguslucorum)JHEH蛋白結(jié)構(gòu)的模擬結(jié)果顯示，其存在與家蠶相似的功能結(jié)構(gòu)域，RNAi干擾JHEH基因表達(dá)導(dǎo)致綠盲蝽幼蟲存活率明顯下降，且部分幼蟲蛻皮困難，甚至死亡無法延續(xù)下一代[14]。半翅目褐飛虱(Nilaparvatalugens)JHEH基因的表達(dá)下調(diào)對幼蟲存活率影響較小，但是顯著增加長翅型褐飛虱種群中短翅個體數(shù)量，達(dá)到總量的50%以上，且以雌性為主[15]。

本研究對斜紋夜蛾JHEH基因(SlJHEH)進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)SlJHEH蛋白，為研究該蛋白質(zhì)的體外活性和生物功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜紋夜蛾幼蟲來自華南師范大學(xué)昆蟲研究所。飼養(yǎng)方法:(1)卵消毒: 在卵孵化前1 d，放入5%的甲醛溶液中消毒15 min，用無菌水漂洗，晾干；(2)幼蟲飼養(yǎng): 將初孵幼蟲接入塑料培養(yǎng)盒中，待長到3齡時，分盒飼養(yǎng)，直到預(yù)蛹期，然后將預(yù)蛹幼蟲轉(zhuǎn)入干凈的飼養(yǎng)盒中化蛹；(3)成蟲產(chǎn)卵: 在蛹羽化前2 d，區(qū)分雌、雄蛹，將蛹按雌雄配對，置于單獨(dú)的培養(yǎng)盒中羽化，蛹羽化后，用15%的蜂蜜飼養(yǎng)，以利于產(chǎn)卵。飼養(yǎng)條件：溫度25～27 ℃，相對濕度70%～75%，光周期16 h∶8 h (光∶暗)。

RNA提取試劑RNAiso plus、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、DL5000 DNA Marker、PCR常用試劑(dNTPs、10×PCR buffer和rTaq)、DNA限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體、Solution Ⅰ、T4 DNA ligase、10× T4 DNA ligase buffer、Premixed protein marker(low)均購自TaKaRa公司(大連，中國)；原裝進(jìn)口低熔點(diǎn)BIOWEST瓊脂糖、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、SDS-PAGE和Western blotting相關(guān)試劑購自鄭州寶賽生物科技有限公司；Western blotting所用硝酸纖維素膜為英國Whatman公司產(chǎn)品；大腸桿菌(E.coli) DH5α、BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞和原核表達(dá)用pET32a 質(zhì)粒由華南師范大學(xué)昆蟲與科學(xué)技術(shù)研究所馮啟理教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 中腸總RNA提取與cDNA的獲得 選取斜紋夜蛾6齡進(jìn)食期3 d的幼蟲，按照RNAiso plus說明書提取中腸總RNA后，用Nanodrop紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆肹16]。按照TaKaRa公司M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書合成第一鏈cDNA，保存于-20 ℃。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與序列擴(kuò)增 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得SlJHEH全長序列(GenBank登錄號：XM_022981795)，設(shè)計(jì)上游引物：5′-GGATCCATGGCGCGCCTGTTGTTTA-3′(劃線處為BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-GTCGACTTACAAATCAGTCTTGAC-3′(劃線處為SalⅠ 酶切位點(diǎn))。引物由安徽通用生物技術(shù)有限公司合成。以上述反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增JHEH目的序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán); 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收。將目的片段與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)過0.1 g/L氨芐青霉素(Amp)篩選單克隆，運(yùn)用PCR和雙酶切鑒定后，送安徽通用生物技術(shù)有限公司測序。將重組載體命名為pMD18T-SlJHEH。測序正確的序列用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 運(yùn)用DNAstar分析開放閱讀框(ORF)、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)。在NCBI 數(shù)據(jù)庫對本研究獲得基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索; 使用Clustal W2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgibin/ESPript.cgi)進(jìn)行同源性比較[13]；通過Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.2.4SlJHEH原核表達(dá)載體的構(gòu)建 運(yùn)用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ對pMD18T-SlJHEH和pET32a空載體進(jìn)行酶切，割膠回收目的片段，經(jīng)T4連接酶16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)過氨芐青霉素篩選單克隆，運(yùn)用PCR和雙酶切鑒定，然后送到安徽通用生物技術(shù)有限公司測序。將重組載體命名為pET32a-SlJHEH。

1.2.5 SlJHEH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET32a-SlJHEH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得的陽性單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含0.1 g/L Amp)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按1∶50 接種于5 mL 含Amp的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，然后于28 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)4 h，收集1.5 mL菌液，于12 000×g下離心10 min以收集細(xì)胞沉淀。用200 μL PBS緩沖液(NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g,加水至1 L,pH值7.4) 懸浮沉淀，超聲波破碎至液體透明(超聲功率為400 W,工作5 s，間隔5 s,重復(fù)一定次數(shù))，于12 000×g離心10 min，分別收集上清和沉淀。以未重組載體pET32a作為對照，所有試驗(yàn)條件保持一致。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳和Western blotting分析 取菌體、上清和沉淀各10 μL，并分別加入10 μL的2×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，冰上放置3 min。采用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離15 μL的樣品，以未重組載體pET32a作為對照，處理?xiàng)l件保持一致。蛋白質(zhì)凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，最后成像分析。

蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用封閉液(含3%牛血清白蛋白)于37 ℃封閉2 h。然后與His標(biāo)簽抗體(1∶10 000稀釋) 于30 ℃下反應(yīng)1 h，用洗滌液洗膜3次，每次10 min。與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體 (Anti-IgG AP conjugate) (1∶2 000稀釋) 于30 ℃下反應(yīng)1 h，然后用洗滌液洗膜4次，每次5 min。最后用四氮唑蘭(NBT)/5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸鹽(BCIP)進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾中腸RNA的提取

利用RNAiso plus提取斜紋夜蛾6齡進(jìn)食期3 d中腸的總RNA，Nanodrop紫外分光光度計(jì)測得其質(zhì)量濃度為3 265 ng/μL，A260/A280值為1.942，A260/A230值為2.078。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀下觀察檢測總RNA的質(zhì)量，結(jié)果(圖1)顯示，28S和18S rRNA條帶清晰，提取質(zhì)量良好，無明顯降解。

圖1 斜紋夜蛾中腸總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 斜紋夜蛾JHEH基因的擴(kuò)增與分析

利用特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，得到SlJHEH基因片段(圖2)。該基因ORF長為1 389 bp，編碼462個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為52 ku，等電點(diǎn)為8.68。其中有179個疏水性氨基酸和91個極性氨基酸，經(jīng)分析該蛋白質(zhì)可能為可溶性蛋白。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：PCR產(chǎn)物圖2 SlJHEH基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 斜紋夜蛾JHEH氨基酸序列同源性比對及進(jìn)化樹分析

與其他不同物種的JHEH氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，SlJHEH存在與細(xì)胞膜結(jié)合的高保守性XWG序列(圖3)，推測與其亞細(xì)胞定位有關(guān)[13]。Tyr297、Tyr372和HGWP花樣結(jié)構(gòu)氨基酸殘基組成疏水性陰氧離子洞，活性位點(diǎn)催化三聯(lián)體Asp226、Glu402和His429氨基酸殘基發(fā)揮其水解活性，這2個基本結(jié)構(gòu)是昆蟲或哺乳動物環(huán)氧水解酶發(fā)揮作用的功能性基序[13-14,18]，在不同物種中高度保守(圖3)。

除SlJHEH外，從上至下分別為Helicoverpa armigera(ACM78602)、Trichoplusia ni(AAB88192)、Bombyx mori(NP_001037201)、Spodoptera exigua(ABD85119)、Drosophila melanogaster(ACV04637、NP_611386、AAM88329)、Aedes aegypti(AAM88326)、Manduca sexta(AAC47018)的JHEH蛋白，氨基酸序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫下載，圖4同；▲標(biāo)記N端膜結(jié)合氨基酸；●標(biāo)記活性位點(diǎn)催化三聯(lián)體的Asp226、Glu402、His429殘基；★標(biāo)記組成陰氧離子洞的Tyr297、Tyr372殘基和HGWP花樣結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，SlJHEH與鱗翅目的棉鈴蟲(ACM78602)、粉紋夜蛾(AAB88192)、家蠶(NP_001037201)、小菜蛾(Spodopteraexigua，ABD85119) 和煙草天蛾(AAC47018)的JHEH蛋白很好地聚在一起，尤其與棉鈴蟲JHEH氨基酸序列同源性高達(dá)78%，而與雙翅目果蠅(Drosophilamelanogaster，NP_611386、ACV04637和AAM88329)和埃及伊蚊(Aedesaegypti，AAM88326)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

2.4 重組表達(dá)載體pET32a-SlJHEH的構(gòu)建

將構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET32a-SlJHEH轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株，挑取5個菌落直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 400 bp處均能擴(kuò)增出單一條帶(圖5A)，隨機(jī)挑選其中的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，在1 400 bp處也出現(xiàn)單一條帶(圖5B)，說明JHEH基因已連入pET32a表達(dá)載體。經(jīng)進(jìn)一步測序驗(yàn)證，重組表達(dá)載體pET32a-SlJHEH構(gòu)建成功。

圖4 SlJHEH的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 斜紋夜蛾JHEH重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting鑒定

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)R250染色后，pET32a-SlJHEH轉(zhuǎn)化菌在分子質(zhì)量接近66 ku處，比空載體pET32a轉(zhuǎn)化菌多出一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，表達(dá)蛋白為目的蛋白(分子質(zhì)量52 ku)和pET32a標(biāo)簽(分子質(zhì)量約18 ku)的融合蛋白,檢測結(jié)果與預(yù)測的融合蛋白分子質(zhì)量相符(圖6A)。目的蛋白主要以包涵體形式存在，上清液中有少量可溶性蛋白(圖6A)。采用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting分析，進(jìn)一步確認(rèn)該蛋白質(zhì)為與His標(biāo)簽融合的目的蛋白(圖6B)。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1—5：菌落PCR產(chǎn)物； 6：pET32a-SlJHEH質(zhì)粒酶切前； 7：pET32a-SlJHEH質(zhì)粒酶切后圖5 重組表達(dá)載體pET32a-SlJHEH的PCR(A)和酶切(B)鑒定

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：pET32a誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物； 2：pET32a-SlJHEH誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;3:pET32a-SlJHEH誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清液; 4:pET32a-SlJHEH誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物沉淀圖6 pET32a-SlJHEH表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鑒定

3 結(jié)論與討論

昆蟲末齡幼蟲到蛹期的變態(tài)依賴保幼激素的快速降解[14]。JHEH作為保幼激素降解代謝中的關(guān)鍵酶之一，將JH和JHa降解為JHd和JHad[ 9,19 ]。自從煙草天蛾中克隆出第1個JHEH基因以來[6]，又先后在鱗翅目粉紋夜蛾、家蠶、谷食夜蛾，蚤目貓櫛(Ctenocephalidesfelis)，雙翅目果蠅，直翅目蟋蟀(Gryllusassimilis)，半翅目褐飛虱、綠盲蝽，膜翅目蜜蜂(Apismellifera)，鞘翅目赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)，同翅目棉蚜(Aphisgossypii)等多個目的昆蟲中研究了JHEH基因[7-9,12,14,19-24]。本研究從斜紋夜蛾克隆了JHEH基因的ORF序列，并對其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。SlJHEH基因ORF大小為1 389 bp，編碼462個氨基酸。該序列具有明顯的JHEH酶的典型特征，即氨基酸序列中具有保守的天冬氨酸(Asp226)、組氨酸(His429)和谷氨酸(Glu402)組成的活性位點(diǎn)催化三聯(lián)體，HGWP結(jié)構(gòu)域和2個酪氨酸殘基(Tyr297和Tyr372)組成其陰氧離子洞，N端有膜結(jié)合XWG基序，這些均與家蠶和綠盲蝽JHEH三維結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致[13-14]。

本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中，經(jīng)過一般誘導(dǎo)表達(dá)條件28 ℃誘導(dǎo)4 h，獲得大量的目的融合蛋白，分子質(zhì)量約為66 ku。目的蛋白主要以包涵體形式存在，但是上清中已有少量可溶性的重組蛋白，說明該蛋白質(zhì)為可溶性蛋白，這與推測氨基酸序列分析結(jié)果一致，可進(jìn)一步改變誘導(dǎo)條件增加上清中可溶性蛋白的表達(dá)量。另外，原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類[25]，表達(dá)出來的可溶性蛋白是否具有生物學(xué)活性也需要進(jìn)一步確認(rèn)。根據(jù)pET32a表達(dá)載體的特點(diǎn)，用His標(biāo)簽抗體對誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，有相應(yīng)大小的條帶出現(xiàn)，表明載體按照正確的翻譯框架翻譯并表達(dá)出帶有His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。

JH是昆蟲特異的激素，研究JH生物合成和代謝途徑中的重要酶，對發(fā)現(xiàn)更有效的保幼激素類似物和建立利用DNA重組技術(shù)的新害蟲控制方法有很大幫助。目前，針對煙草天蛾和粉紋夜蛾生物學(xué)特性開發(fā)的特異性酶抑制劑被認(rèn)為是潛在的殺蟲劑[26-27]。本研究克隆了斜紋夜蛾保幼激素環(huán)氧水解酶的基因,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-SlJHEH，并在E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株中成功表達(dá)，下一步將進(jìn)行該酶的體外活性研究。