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(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為云煙87和紅花大金元(簡(jiǎn)稱(chēng)紅大)，種子來(lái)源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司。供試硝酸鉻、重鉻酸鉀以及配制Hoagland營(yíng)養(yǎng)液所需化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司和天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

水培試驗(yàn)于2017年7—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院日光溫室中進(jìn)行。采用漂浮育苗體系培育云煙87和紅大幼苗，待煙苗達(dá)到貓耳期時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的幼苗移植到盛有500 mL Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH值6.0)的水培罐中并用錫箔紙包裹使根部避光，每天通氣2 h，每3 d更換1次培養(yǎng)液(包括指標(biāo)測(cè)定時(shí))。預(yù)培養(yǎng)7 d后，向培養(yǎng)液中加入Cr3+、Cr6+溶液。培養(yǎng)液中Cr3+、Cr6+最終質(zhì)量濃度分別為0(CK)、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L(Cr3+和Cr6+分別由硝酸鉻、重鉻酸鉀提供)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每罐植煙3株，每個(gè)處理共植煙9株，在處理的第15天和第30天取樣測(cè)定各指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

在處理第15天和第30天用打孔器取3～6葉位一定質(zhì)量的真葉，立即放入液氮中保存，隨后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。硝態(tài)氮、游離氨基酸、可溶性蛋白含量測(cè)定參考王小純等[13]的方法；硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性和葉綠素含量測(cè)定方法參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[14]；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性測(cè)定參照吳良?xì)g等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013整理，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，用Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同價(jià)態(tài)鉻對(duì)煙草幼苗氮同化的影響

2.1.1 硝態(tài)氮含量 由表1可知，除0.1～0.5 mg/L Cr3+處理30 d的紅大幼葉硝態(tài)氮含量高于CK外，其他處理煙葉硝態(tài)氮含量均低于CK。在不同價(jià)態(tài)鉻脅迫下，2個(gè)烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)大致相同：云煙87在Cr3+處理15、30 d和Cr6+處理15 d，以及紅大在Cr3+、Cr6+分別處理15 d，幼葉硝態(tài)氮含量隨鉻質(zhì)量濃度增加呈先降低后增加再降低趨勢(shì)；而Cr6+處理30 d，2個(gè)烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量均隨鉻質(zhì)量濃度增加而降低。其中，云煙87幼葉硝態(tài)氮含量在0.5 mg/L Cr3+處理下達(dá)到最高，但處理15、30 d時(shí)仍分別較CK降低11.0%、5.8%；而在0.5 mg/L Cr6+處理15、30 d時(shí)分別較CK降低14.3%、14.5%。紅大幼葉硝態(tài)氮含量在0.5 mg/L Cr3+處理15、30 d時(shí)分別比CK降低15.6%、提高20.05%(P<0.05)；而在0.5 mg/L Cr6+處理15、30 d時(shí)分別比CK降低8.1%、22.7%。Cr3+脅迫下，處理30 d的烤煙幼葉硝態(tài)氮含量均高于處理15 d(云煙87 CK除外)。0.1 mg/L Cr6+脅迫下，處理30 d 2個(gè)烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量均高于處理15 d； 0.5～5.0 mg/L Cr6+脅迫下則低于處理15 d。0.1～5.0 mg/L Cr6+處理15 d，紅大幼葉硝態(tài)氮含量高于云煙87；高質(zhì)量濃度鉻(1.0～5.0 mg/L)處理30 d，Cr3+處理的2個(gè)烤煙品種幼葉硝態(tài)氮含量高于Cr6+處理。

表1 不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙苗葉片硝態(tài)氮含量的影響 mg/g

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；同列不同小、大寫(xiě)字母分別表示同一品種不同質(zhì)量濃度鉻處理在5%、1%水平上差異顯著、極顯著，下同。

2.1.2 NR活性 從表2可以看出，Cr3+處理15、30 d，2個(gè)烤煙品種幼葉NR活性隨鉻質(zhì)量濃度增加均呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。云煙87、紅大幼葉NR活性分別在0.5、1.0 mg/L Cr3+處理達(dá)到峰值，其中，處理15 d時(shí)2個(gè)品種分別為 9.08、9.07 μg/(g·h)，較CK分別增加18.4%、14.8%，處理30 d時(shí)分別為14.26、11.40 μg/(g·h)，較CK分別降低2.6%、8.4%。Cr6+處理下，2個(gè)烤煙品種幼葉NR活性隨鉻質(zhì)量濃度增加而降低，尤其是Cr6+質(zhì)量濃度增加至>1.0 mg/L后，NR活性極顯著低于CK，但紅大明顯高于云煙87。5 mg/L Cr6+處理15、30 d，紅大幼葉的NR活性較云煙87分別高43.7%、14.8%。相同鉻質(zhì)量濃度脅迫下，處理30 d的NR活性明顯高于處理15 d。

表2 不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙苗葉片NR活性的影響 μg/(g·h)

2.1.3 GS活性 從圖1可以看出，鉻處理下2個(gè)烤煙品種的GS活性均低于CK。Cr3+處理15 d時(shí)，云煙87、紅大幼葉GS活性隨鉻質(zhì)量濃度增大均呈逐漸降低趨勢(shì)，其中5 mg/L Cr3+處理下分別較CK顯著降低45.2%、31.8%。Cr3+處理30 d和Cr6+處理15 d時(shí)，云煙87、紅大幼葉GS活性隨鉻質(zhì)量濃度增加均呈先降低后增加再降低的趨勢(shì)，二者均在鉻質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時(shí)達(dá)到峰值，但仍分別較CK降低1.7%、19.3%(Cr3+處理30 d)和3.0%、12.9%(Cr6+處理15 d)。0.1、0.5 mg/L Cr6+處理15 d 2個(gè)烤煙品種幼葉GS活性與CK差異均不顯著。Cr6+處理30 d時(shí)，云煙87、紅大幼葉GS活性隨Cr6+質(zhì)量濃度增加而降低，其中0.1 mg/L Cr6+處理下分別較CK顯著降低21.35%、30.28%。

不同小寫(xiě)字母表示同一價(jià)態(tài)鉻脅迫相同時(shí)間不同質(zhì)量濃度處理間在0.05水平上差異顯著，下同

2.2 不同價(jià)態(tài)鉻對(duì)煙草幼苗氮轉(zhuǎn)化的影響

2.2.1 GPT活性 由圖2可以看出，短時(shí)間Cr3+處理下，2個(gè)烤煙品種幼葉GPT活性呈降低—升高—降低的趨勢(shì)。云煙87在0.5 mg/L Cr3+處理15 d時(shí)，幼葉GPT活性較CK降低5.1%，而在0.1 mg/L Cr3+處理30 d時(shí)GPT活性達(dá)到最大值，比CK顯著增加12.8%。紅大在1 mg/L Cr3+處理時(shí)幼葉GPT活性達(dá)到最大值，處理15、30 d分別比CK提高18.1%、0.4%。Cr6+處理下，隨鉻質(zhì)量濃度增大，云煙87幼葉GPT活性逐漸降低，0.1 mg/L Cr6+處理30 d時(shí)較CK顯著降低34.7%；紅大幼葉GPT活性整體上則呈降低—升高—降低的趨勢(shì)，在 1.0 mg/L Cr6+處理下達(dá)到峰值，但處理15、30 d仍分別較CK顯著降低30.5%、13.2%?？傮w來(lái)看，Cr3+處理下烤煙幼葉GPT活性略高于Cr6+處理，且處理30 d高于處理15 d，紅大高于云煙87。

圖2 不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙苗葉片GPT活性的影響

2.2.2 游離氨基酸含量 由圖3可以看出，不同價(jià)態(tài)鉻脅迫15、30 d，2個(gè)烤煙品種幼葉游離氨基酸含量均隨鉻質(zhì)量濃度增加而逐漸降低。除0.1 mg/L Cr3+處理2個(gè)品種和Cr6+處理15 d紅大的幼葉游離氨基酸含量與CK無(wú)顯著差異外，其他質(zhì)量濃度Cr3+和Cr6+處理的煙葉游離氨基酸含量均顯著低于CK。1.0 mg/L Cr3+脅迫15、30 d，云煙87幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低47.5%、45.7%，紅大幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低24.8%、23.7%。1.0 mg/L Cr6+脅迫15、30 d，云煙87幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低52.3%、46.1%，紅大幼葉游離氨基酸含量分別較CK降低35.2%、38.5%。整體來(lái)看，紅大幼葉內(nèi)游離氨基酸含量略高于云煙87。

圖3 不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙苗葉片游離氨基酸含量的影響

2.2.3 可溶性蛋白含量 由圖4可知，Cr3+處理15 d，2個(gè)烤煙品種幼葉可溶性蛋白含量略有降低，與CK差異不顯著；Cr3+處理30 d，云煙87和紅大幼葉可溶性蛋白含量顯著高于CK，但各脅迫處理間差異不顯著，其中云煙87、紅大幼葉可溶性蛋白含量分別在Cr3+質(zhì)量濃度為0.1、0.5 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，分別較CK顯著增加15.5%、14.1%。Cr6+處理15 d，云煙87幼葉可溶性蛋白含量顯著低于CK，而紅大各處理可溶性蛋白含量與CK差異不顯著；Cr6+處理30 d，云煙87和紅大幼葉可溶性蛋白含量均高于CK，二者分別在0.1、0.5 mg/L Cr6+處理最高，分別較CK增加13.2%、4.6%。

圖4 不同價(jià)態(tài)鉻脅迫對(duì)煙苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同價(jià)態(tài)鉻對(duì)煙草幼苗色素含量的影響

由圖5可以看出，Cr3+處理15 d，云煙87的葉綠素a、b含量隨鉻質(zhì)量濃度增加呈先減少后增加再減少趨勢(shì)，類(lèi)胡蘿卜素含量則逐漸降低，0.5 mg/L Cr3+處理時(shí)葉綠素b含量達(dá)到最大值，較CK顯著增加19.0%；而紅大幼葉的葉綠素a、b和胡蘿卜素含量在Cr3+脅迫15 d較CK提高。0.1～5.0 mg/L Cr3+處理30 d時(shí)，2個(gè)烤煙品種的葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量與CK相差不大；隨鉻質(zhì)量濃度增加，云煙87的葉綠素b含量表現(xiàn)為先增加后減少，紅大則表現(xiàn)為減少—增加—減少。Cr6+處理15 d時(shí)，云煙87的葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著低于CK；而紅大在0.1～0.5 mg/L Cr6+處理下幼葉葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量較CK提高，葉綠素b含量在0.1 mg/L Cr6+處理時(shí)達(dá)到最大值。不同質(zhì)量濃度Cr6+處理30 d，2個(gè)烤煙品種的葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量變化較?。?.1～5.0 mg/L Cr6+處理30 d，云煙87的葉綠素b含量隨Cr6+質(zhì)量濃度增加而逐漸降低，但均顯著高于CK，而紅大的葉綠素b含量則呈現(xiàn)增加—減少—增加的趨勢(shì)。云煙87、紅大的幼葉葉綠素b含量分別在0.1、0.5 mg/L Cr6+處理30 d時(shí)最高，為8.35、8.72 mg/g，分別比CK增加63.1 %、1.9%。整體來(lái)看，Cr3+和Cr6+對(duì)云煙87和紅大的葉綠素b含量影響較大。隨著處理時(shí)間增加，處理30 d的幼葉葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量高于處理15 d，而葉綠素b含量則低于處理15 d。

A、B為Cr3+處理，C、D為Cr6+處理

3 結(jié)論與討論

氮素代謝途徑中多種中間代謝產(chǎn)物或含氮有機(jī)物對(duì)緩解環(huán)境脅迫起著重要作用[20]。氨基酸和蛋白質(zhì)是銨態(tài)氮的同化產(chǎn)物，它們對(duì)植株的氮代謝以及逆境脅迫下植株的抗性具有重要作用[21]。GPT在氨基酸合成和蛋白質(zhì)分解代謝中起著重要的中介作用。游離氨基酸含量和GPT活性可部分反映氮轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度。本研究中，低質(zhì)量濃度(0.1 mg/L)Cr3+處理15 d，2個(gè)烤煙品種煙葉游離氨基酸含量減少，可溶性蛋白含量也略有降低，GPT活性降低；處理30 d，游離氨基酸含量減少，可溶性蛋白含量增加，云煙87幼葉GPT活性增加而紅大降低。而Cr6+處理下，GPT活性和游離氨基酸含量隨鉻質(zhì)量濃度增加而逐漸降低，但處理30 d時(shí)各處理可溶性蛋白含量卻高于CK。該結(jié)果表明，Cr3+和Cr6+脅迫能減少煙草中的游離氨基酸積累。另外，在相同鉻質(zhì)量濃度脅迫下，2個(gè)烤煙品種的NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、葉綠素a、類(lèi)胡蘿卜素含量，以及云煙87游離氨基酸含量均表現(xiàn)為處理30 d高于處理15 d，說(shuō)明隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，煙苗自身生理機(jī)制逐漸完善并對(duì)鉻傷害產(chǎn)生一定的適應(yīng)性，從而提高抵抗外界傷害的能力。葉片可溶性蛋白含量增加可能是因?yàn)樵茻?7和紅大煙苗對(duì)鉻離子有一個(gè)自身適應(yīng)期，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)鉻能促進(jìn)煙草植物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成代謝，誘導(dǎo)合成更多的可溶性蛋白，參與滲透調(diào)節(jié)，提高抗逆性，這與張艷英等[18]的研究結(jié)果一致。趙全志等[22]在水稻上的研究表明，氮同化酶GS、GOGAT活性高低與葉綠素的合成及葉色變化密切相關(guān)。氮作為葉綠素分子的重要組分，對(duì)葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育具有重要作用。研究表明，葉綠素含量高，葉片氮代謝旺盛，葉片衰老延緩[23]。本試驗(yàn)研究中，低質(zhì)量濃度(0.1 mg/L)Cr3+處理在短時(shí)間內(nèi)增加了紅大的葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素含量；但隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，紅大的葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量略有降低，葉綠素a含量與CK相差不大；0.5 mg/L Cr3+處理15、30 d，云煙87的葉綠素b含量比CK顯著增加，而葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量降低。結(jié)果表明，0.5 mg/L Cr3+能促進(jìn)云煙87葉綠素b含量的積累，降低其葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量，這可能是因?yàn)槿~綠素b對(duì)Cr3+的變化較敏感，具體原因還有待進(jìn)一步探討。另外，云煙87在0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+短時(shí)間處理下葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量均低于CK，而紅大則大于CK，說(shuō)明一定濃度鉻處理一定時(shí)間下對(duì)云煙87葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量的影響大于紅大。

從氮代謝各指標(biāo)和葉綠素含量綜合來(lái)看，煙苗在生長(zhǎng)過(guò)程中，氮轉(zhuǎn)化和氮同化在鉻脅迫初期和低質(zhì)量濃度鉻脅迫下會(huì)表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)作用，究其原因，一方面可能是逆境下的煙草通過(guò)加強(qiáng)代謝，激活相關(guān)保護(hù)酶系統(tǒng)來(lái)緩解逆境帶來(lái)的傷害，另一方面可能是由于補(bǔ)償效應(yīng)，即植物在結(jié)構(gòu)和生理水平上對(duì)閾值內(nèi)的逆境脅迫條件產(chǎn)生一種利于作物生長(zhǎng)發(fā)育的能力，對(duì)引起的損失具有彌補(bǔ)作用，是煙株對(duì)脅迫的一種本能適應(yīng)性[24-26]。但隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)以及鉻質(zhì)量濃度的增加，部分氮代謝相關(guān)指標(biāo)和酶活性指標(biāo)出現(xiàn)降低趨勢(shì)，氮轉(zhuǎn)化和氮同化過(guò)程受抑制，最終影響煙苗的氮代謝。

綜上所述，Cr6+對(duì)煙葉氮代謝和葉綠素含量的影響大于Cr3+。在0.1～5.0 mg/L鉻處理下，烤煙幼葉的GS活性、游離氨基酸含量均低于CK(無(wú)鉻處理)；長(zhǎng)時(shí)間(30 d)脅迫下，0.5 mg/L Cr3+處理云煙87的硝態(tài)氮、葉綠素b含量和NR、GS活性最高，1.0 mg/L Cr3+和Cr6+處理紅大的GPT活性最高，而高濃度(5.0 mg/L)鉻對(duì)2個(gè)烤煙品種氮代謝指標(biāo)的抑制作用最大。鉻脅迫處理30 d烤煙幼葉NR、GS、GPT活性，可溶性蛋白、葉綠素a、類(lèi)胡蘿卜素含量均高于處理15 d。鉻對(duì)紅大和云煙87葉片氮代謝相關(guān)指標(biāo)的抑制作用存在差異。0.1～0.5 mg/L Cr3+和Cr6+處理15 d時(shí)，云煙87葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素含量的降低幅度大于紅大，Cr6+處理下紅大的NR、GS、GPT活性和硝態(tài)氮、氨基酸含量高于云煙87，且云煙87幼葉可溶性蛋白含量受Cr6+影響大于紅大。因此，紅大對(duì)鉻脅迫的抵抗力稍強(qiáng)于云煙87，在今后的煙草耐性研究中可考慮選擇紅花大金元作為耐鉻品種進(jìn)行研究。