張立營(yíng) 趙權(quán)

變態(tài)反應(yīng)也稱為過(guò)敏反應(yīng)，這意味著免疫系統(tǒng)對(duì)某些對(duì)身體無(wú)害的物質(zhì)(如花粉，動(dòng)物皮膚等)過(guò)于敏感，并且會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，對(duì)身體造成傷害。人們每天遇到的皮膚過(guò)敏，皮膚瘙癢，發(fā)紅和腫脹都是過(guò)敏反應(yīng)。Ⅰtypeallergy又稱速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，在臨床上最常見(jiàn)。全世界有30%～40%的人被過(guò)敏問(wèn)題困擾，過(guò)敏已成為全球第六大疾病[1-2]。日常生活中常見(jiàn)的過(guò)敏反應(yīng)主要是以IgE抗體(specific IgE antibodies，sIgE)介導(dǎo)、組胺等介質(zhì)釋放為基礎(chǔ)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)而產(chǎn)生。通過(guò)檢測(cè)患者血清過(guò)敏原的特異性IgE抗體，可明確患者的過(guò)敏原，對(duì)于疾病的預(yù)防、診斷及治療均具重要意義。本文按照反應(yīng)原理闡述了目前過(guò)敏原特異性IgE抗體的體外檢測(cè)常見(jiàn)技術(shù)，并對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行了分析。

1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)

1971年，瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann報(bào)道了ELISA，ELISA是一種免疫標(biāo)記技術(shù)，其中已知的抗原或抗體吸附在固相載體的表面上，以使酶標(biāo)記的抗原-抗體在固體表面上反應(yīng)[3]。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化載體的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)IgE抗體時(shí)，普通酶免法是將過(guò)敏原包被在固相載體上，然后加入患者血清，此時(shí)患者血清中除了特異性IgE抗體外，特異性IgG抗體也會(huì)和過(guò)敏原結(jié)合，造成載體上部分位點(diǎn)的搶占。而捕獲法是將抗人IgE抗體包被在固相載體上，加入患者血清后，血清中的IgE抗體都被結(jié)合，而IgG抗體不會(huì)被結(jié)合下來(lái)而被洗脫，隨后加入待檢過(guò)敏原，再加入酶和底物顯色。由于該法去除了血清中IgG抗體的干擾，從而明顯提高了IgE抗體檢測(cè)的靈敏度。使用捕獲法可以完全捕獲出血清中的IgE抗體，去除IgG抗體干擾，顯著提高檢測(cè)IgE水平的敏感度，并且可以實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原自由靈活組合、定量檢測(cè)[4-5]。

2 放射過(guò)敏原吸附試驗(yàn)(radio allergosorbent test，RAST)方法

RAST將純化的過(guò)敏原與固相載體相結(jié)合，添加待測(cè)血清和參照對(duì)照，然后與同位素標(biāo)記的抗IgE抗體反應(yīng)，然后測(cè)定固相的放射活性，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)血清中特異性IgE的含量，或者當(dāng)樣品的放射性高于正常人數(shù)加3S時(shí)判斷為陽(yáng)性。這種試驗(yàn)方法的發(fā)展首次使得對(duì)過(guò)敏原特異性IgE進(jìn)行可靠的識(shí)別，至此，過(guò)敏原特異性IgE水平的體外測(cè)定及過(guò)敏癥臨床病史開(kāi)始成為過(guò)敏癥研究及臨床診斷方面的根基。RAST的原理是在固體載體上使過(guò)敏原與相關(guān)特異人群血清的IgE結(jié)合，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IgE，利用同位素或酶標(biāo)記抗體，配合熒光底物檢測(cè)結(jié)合IgE的抗體[6-7]。RAST方法雖然簡(jiǎn)便、快速、靈敏，但由于應(yīng)用到放射性標(biāo)記物質(zhì)，存在一定的放射性污染風(fēng)險(xiǎn)。

3 免疫印跡法(Western blot，WB)

WB是一種將高分辨率凝膠電泳與免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)?；驹硎峭ㄟ^(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理的細(xì)胞素膜)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分[8-10]。

4 化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)

CLIA將高靈敏度化學(xué)發(fā)光測(cè)量技術(shù)與高度特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測(cè)和分析各種抗原，半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物。它是放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析后開(kāi)發(fā)的一種新的免疫分析方法。從臨床實(shí)踐看，當(dāng)血液樣本中的IgE濃度很低時(shí)，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)由于受到檢測(cè)靈敏度、特異度和檢測(cè)范圍等因素的限制可能出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果陰陽(yáng)性不符的情況。納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)綜合采用了目前國(guó)際上的兩大主流免疫分析尖端技術(shù)——懸浮磁微粒載體技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，該系統(tǒng)具有檢測(cè)范圍寬、靈敏度高、特異度強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)和特性，從方法學(xué)角度來(lái)看其優(yōu)于熒光酶免法[11-14]。其優(yōu)勢(shì)在于過(guò)敏原可以隨機(jī)、自由組合，敏感度高、特異度強(qiáng)，全定量。

5 微流控芯片技術(shù)(microfluidics)

微流控芯片技術(shù)將生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)分析過(guò)程中的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作單元集成到微米級(jí)芯片上，自動(dòng)完成整個(gè)分析過(guò)程[15-18]。目前有該技術(shù)用于過(guò)敏原IgE抗體檢測(cè)，此微流體免疫技術(shù)系統(tǒng)將自動(dòng)化微流體技術(shù)、蛋白質(zhì)微數(shù)組技術(shù)、冷光分析技術(shù)與平行化IgE分析技術(shù)相結(jié)合。將過(guò)敏原固定于微流卡反應(yīng)區(qū)，可同時(shí)平行處理數(shù)十種過(guò)敏原特異性IgE抗體，藉由微流體的導(dǎo)入，血清用量?jī)H需100微升；隨后通過(guò)加入試劑進(jìn)行相應(yīng)反應(yīng)并置于化學(xué)發(fā)光分析儀上進(jìn)行判讀結(jié)果，全程約35 min完成[19-20]。此技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高、快速、樣本量需求少，但目前還缺少大通量自動(dòng)化儀器。

6 總結(jié)

研發(fā)過(guò)敏原體外診斷檢測(cè)技術(shù)是過(guò)敏性疾病預(yù)防、診斷和治療的核心之一。近年來(lái)，過(guò)敏性疾病基于IgE抗體檢測(cè)而診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究發(fā)展迅速，形成了諸多檢測(cè)手段。在分級(jí)診療的大背景下，不同級(jí)別醫(yī)院對(duì)于過(guò)敏原特異性IgE抗體體外檢測(cè)的性能需求不同。基層醫(yī)院以滿足過(guò)敏患者首診需求、降低費(fèi)用為主，會(huì)以定性/半定量篩查或靈活組合為主，三級(jí)醫(yī)院為保證檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性，會(huì)更需要全定量檢測(cè)產(chǎn)品。目前在國(guó)內(nèi)全定量檢測(cè)產(chǎn)品仍較少，且成本高昂，不利于全面開(kāi)展變態(tài)反應(yīng)臨床工作。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展以及過(guò)敏性疾病診治研究進(jìn)展的深入，過(guò)敏原檢測(cè)的定性或半定量技術(shù)將逐漸向定量轉(zhuǎn)變。過(guò)敏原體外診斷檢測(cè)技術(shù)有著光明的發(fā)展前景。