王路敏，李艷萍，夏俊杰，葉巖榮*

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門(mén)醫(yī)院，福建 廈門(mén) 361000；

2.莆田醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所，福建 廈門(mén) 361102）

在進(jìn)行同種移植后,移植抗原可刺激受體發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng),通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫的共同作用使移植物受損的情況稱(chēng)為宿主抗移植物反應(yīng)[1-2]。同種異體移植的排斥機(jī)制：適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識(shí)別供體組織上表達(dá)的不匹配的HLA等位基因產(chǎn)物[3]，并對(duì)排斥作用負(fù)責(zé)。發(fā)生抗體介導(dǎo)還是T細(xì)胞介導(dǎo)（CMI）的排斥,取決于移植組織的來(lái)源，如皮膚主要為CMI介導(dǎo)的排斥,而腎臟則為抗體額CMI共同介導(dǎo)。在供體與受體之間HLA不匹配的數(shù)目（移植抗原數(shù)）通常決定排斥作用的強(qiáng)度。

T細(xì)胞介導(dǎo)免疫排斥的機(jī)制[4]：在同種移植中,Th1細(xì)胞主要參與急性排斥反應(yīng)，Th2細(xì)胞的活化可以導(dǎo)致形成移植耐受。Th1細(xì)胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ等,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、器官特異自身免疫性疾病和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，在宿主抗胞內(nèi)病原感染中起重要作用。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、感染性和過(guò)敏性疾病[5]。

1 材料與方法

1.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）是一種很常用的絲裂原，他可以活化T淋巴細(xì)胞從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，Treg（CD4+CD25+）與Teff（CD4+CD25-）的活化都會(huì)受到ConA的影響,我們利用刀豆蛋白 A 刺激反應(yīng)細(xì)胞使其進(jìn)行增殖,在細(xì)胞中加梯度濃度的地磷莫斯,檢測(cè)細(xì)胞增殖程度,判斷其是否被地磷莫斯抑制。

1.2 T細(xì)胞克隆無(wú)能實(shí)驗(yàn)

反應(yīng)細(xì)胞的提取參照上述淋巴細(xì)胞提取過(guò)程與T細(xì)胞提取過(guò)程,刺激劑可以是供體鼠脾臟細(xì)胞,也可以是ConA,將刺激劑與反應(yīng)細(xì)胞混合如混合淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，每孔加入100 U/ml IL-2，培養(yǎng)72小時(shí)，用Brdu摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3 淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞提取與處理

淋巴細(xì)胞提取如上述方法，將提取好的淋巴細(xì)胞1×106加入96孔板內(nèi),并加入梯度濃度的地磷莫斯溶液，培養(yǎng)72小時(shí)。

1.3.2 樣品染色

淋巴細(xì)胞收集：吸取96孔板內(nèi)的淋巴細(xì)胞，置于1.5 mL EP管內(nèi)，加800 uL的PBS清洗。

用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g,4℃離心5 min。收集1～5×105 細(xì)胞。

加入100μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。

加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。

避光、室溫反應(yīng)10 min。

加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 地磷莫斯(deforolimus)對(duì)淋巴細(xì)胞/T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的抑制作用

（1）為了研究地磷莫斯（deforolimus）在體外對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響,地磷莫斯是否對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用,其抑制作用是否呈劑量依賴(lài)性等,我們提取 B6 小鼠的脾臟細(xì)胞,體外用 ConA 刺激增殖,并加入不同濃度的地磷莫斯(地磷莫斯溶解在純酒精里,且濃度為0，0.1，0.5,1，5 μg/mL的儲(chǔ)液,工作濃度為0，1，5，10，50 ng/mL),放入 37℃孵育箱中,培養(yǎng)72小時(shí),使用Brdu摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果：當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)到1 ng/mL的時(shí)候,其抑制率有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾?，其抑制率沒(méi)有顯著性差異。所以，當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)1 ng/mL時(shí),其抑制率已達(dá)到最大。

（2）運(yùn)用同樣的方法，我們對(duì)地磷莫斯抑制T細(xì)胞的增殖進(jìn)行研究,地磷莫斯的加入,明顯抑制了T細(xì)胞的增殖,其抑制率大于60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），隨著藥物濃度的增加，T細(xì)胞的抑制率沒(méi)有顯著變化，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。濃度為1 ng/mL的地磷莫斯已對(duì)T細(xì)胞有顯著的抑制作用。因此，在藥物濃度是1 ng/mL的時(shí)候已經(jīng)達(dá)到最大抑制率。

2.2 地磷莫斯對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響

在缺血再灌注、組織缺血重構(gòu)、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、腫瘤的發(fā)生等疾病的病理生理機(jī)制研究中,關(guān)于凋亡機(jī)制的研究具有很大的意義,可以進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)到疾病的本質(zhì),因此可以有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)針對(duì)凋亡機(jī)制的靶向藥物,從而提高療效。

我們研究地磷莫斯是否可以引起淋巴細(xì)胞的凋亡，用ConA刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，不同的孔內(nèi)加入梯度濃度的地磷莫斯（0，1，5，10，50 ng/mL），培養(yǎng)72 h后取出,采用凋亡試劑盒對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，然后流式上機(jī)檢測(cè)。地磷莫斯對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響。隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾?，淋巴?xì)胞的凋亡比例沒(méi)有增加，其變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，地磷莫斯不會(huì)引起淋巴細(xì)胞的凋亡。

2.4 地磷莫斯對(duì)T細(xì)胞克隆無(wú)能的影響

T細(xì)胞激活需要兩個(gè)信號(hào)的刺激：第一信號(hào)是形成的pMHC復(fù)合物被抗原遞呈細(xì)胞（APCs）遞呈給T細(xì)胞；第二信號(hào)通過(guò)T細(xì)胞與APCs表面的多對(duì)免疫分子結(jié)合，形成共刺激信號(hào)。當(dāng)T細(xì)胞缺乏第二信號(hào),其接觸抗原后無(wú)反應(yīng)性,形成了克隆無(wú)能狀態(tài)，從而產(chǎn)生特異性T細(xì)胞耐受。克隆無(wú)能組成外周免疫耐受的主要部分，也是避免自身免疫疾病的重要機(jī)制。APCs與共刺激分子的任何一個(gè)信號(hào)的缺乏都可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆無(wú)能，一些促進(jìn)T細(xì)胞的細(xì)胞因子（IL-2）的缺乏也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆無(wú)能。T細(xì)胞被誘導(dǎo)克隆無(wú)能后可以通過(guò)加入IL-2來(lái)恢復(fù)其增殖能力，因此，我們可以通過(guò)加入IL-2后其增殖能力恢復(fù)與否來(lái)判斷T細(xì)胞是否是被誘導(dǎo)克隆無(wú)能而影響其增殖能力。提取脾臟細(xì)胞，用尼龍毛過(guò)柱，提出T細(xì)胞，用ConA刺激T細(xì)胞增殖，在不同的孔加入梯度濃度的地磷莫斯（0，0.5，1 ng/mL），濃度為0.5 ng/mL的地磷莫斯沒(méi)有對(duì)T細(xì)胞的增殖沒(méi)有起到抑制作用,當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)1 ng/mL時(shí)，T細(xì)胞的增殖被抑制，而加入IL-2之后，T細(xì)胞的增殖恢復(fù)。

由此得知,克隆無(wú)能是地磷莫斯對(duì)T細(xì)胞抑制的作用機(jī)制之一。

通過(guò)本課題的研究,我們證實(shí)地磷莫斯確實(shí)有免疫抑制作用，其抑制淋巴細(xì)胞的增殖，特別是T細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)誘導(dǎo)克隆無(wú)能等方法起到免疫抑制的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不是地磷莫斯起免疫抑制作用的方式。