王路敏，李艷萍，夏俊杰，葉巖榮*

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院，福建 廈門 361000；

2.莆田醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所，福建 廈門 361102）

在進(jìn)行同種移植后,移植抗原可刺激受體發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng),通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫的共同作用使移植物受損的情況稱為宿主抗移植物反應(yīng)[1-2]。同種異體移植的排斥機(jī)制：適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識(shí)別供體組織上表達(dá)的不匹配的HLA等位基因產(chǎn)物[3]，并對(duì)排斥作用負(fù)責(zé)。發(fā)生抗體介導(dǎo)還是T細(xì)胞介導(dǎo)（CMI）的排斥,取決于移植組織的來(lái)源，如皮膚主要為CMI介導(dǎo)的排斥,而腎臟則為抗體額CMI共同介導(dǎo)。在供體與受體之間HLA不匹配的數(shù)目（移植抗原數(shù)）通常決定排斥作用的強(qiáng)度。

T細(xì)胞介導(dǎo)免疫排斥的機(jī)制[4]：在同種移植中,Th1細(xì)胞主要參與急性排斥反應(yīng)，Th2細(xì)胞的活化可以導(dǎo)致形成移植耐受。Th1細(xì)胞分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ等,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、器官特異自身免疫性疾病和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，在宿主抗胞內(nèi)病原感染中起重要作用。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、感染性和過(guò)敏性疾病[5]。

1 材料與方法

1.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）是一種很常用的絲裂原，他可以活化T淋巴細(xì)胞從而促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，Treg（CD4+CD25+）與Teff（CD4+CD25-）的活化都會(huì)受到ConA的影響,我們利用刀豆蛋白 A 刺激反應(yīng)細(xì)胞使其進(jìn)行增殖,在細(xì)胞中加梯度濃度的地磷莫斯,檢測(cè)細(xì)胞增殖程度,判斷其是否被地磷莫斯抑制。

1.2 T細(xì)胞克隆無(wú)能實(shí)驗(yàn)

反應(yīng)細(xì)胞的提取參照上述淋巴細(xì)胞提取過(guò)程與T細(xì)胞提取過(guò)程,刺激劑可以是供體鼠脾臟細(xì)胞,也可以是ConA,將刺激劑與反應(yīng)細(xì)胞混合如混合淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，每孔加入100 U/ml IL-2，培養(yǎng)72小時(shí)，用Brdu摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3 淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞提取與處理

淋巴細(xì)胞提取如上述方法，將提取好的淋巴細(xì)胞1×106加入96孔板內(nèi),并加入梯度濃度的地磷莫斯溶液，培養(yǎng)72小時(shí)。

1.3.2 樣品染色

淋巴細(xì)胞收集：吸取96孔板內(nèi)的淋巴細(xì)胞，置于1.5 mL EP管內(nèi)，加800 uL的PBS清洗。

用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300 g,4℃離心5 min。收集1～5×105 細(xì)胞。

加入100μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。

加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。

避光、室溫反應(yīng)10 min。

加入400 μL 1×Binding Buffer,混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 地磷莫斯(deforolimus)對(duì)淋巴細(xì)胞/T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的抑制作用

（1）為了研究地磷莫斯（deforolimus）在體外對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響,地磷莫斯是否對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用,其抑制作用是否呈劑量依賴性等,我們提取 B6 小鼠的脾臟細(xì)胞,體外用 ConA 刺激增殖,并加入不同濃度的地磷莫斯(地磷莫斯溶解在純酒精里,且濃度為0，0.1，0.5,1，5 μg/mL的儲(chǔ)液,工作濃度為0，1，5，10，50 ng/mL),放入 37℃孵育箱中,培養(yǎng)72小時(shí),使用Brdu摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果：當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)到1 ng/mL的時(shí)候,其抑制率有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾?，其抑制率沒(méi)有顯著性差異。所以，當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)1 ng/mL時(shí),其抑制率已達(dá)到最大。

（2）運(yùn)用同樣的方法，我們對(duì)地磷莫斯抑制T細(xì)胞的增殖進(jìn)行研究,地磷莫斯的加入,明顯抑制了T細(xì)胞的增殖,其抑制率大于60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），隨著藥物濃度的增加，T細(xì)胞的抑制率沒(méi)有顯著變化，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。濃度為1 ng/mL的地磷莫斯已對(duì)T細(xì)胞有顯著的抑制作用。因此，在藥物濃度是1 ng/mL的時(shí)候已經(jīng)達(dá)到最大抑制率。

2.2 地磷莫斯對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響

在缺血再灌注、組織缺血重構(gòu)、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、腫瘤的發(fā)生等疾病的病理生理機(jī)制研究中,關(guān)于凋亡機(jī)制的研究具有很大的意義,可以進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)到疾病的本質(zhì),因此可以有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)針對(duì)凋亡機(jī)制的靶向藥物,從而提高療效。

我們研究地磷莫斯是否可以引起淋巴細(xì)胞的凋亡，用ConA刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，不同的孔內(nèi)加入梯度濃度的地磷莫斯（0，1，5，10，50 ng/mL），培養(yǎng)72 h后取出,采用凋亡試劑盒對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，然后流式上機(jī)檢測(cè)。地磷莫斯對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡的影響。隨著地磷莫斯?jié)舛鹊脑黾?，淋巴?xì)胞的凋亡比例沒(méi)有增加，其變化不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，地磷莫斯不會(huì)引起淋巴細(xì)胞的凋亡。

2.4 地磷莫斯對(duì)T細(xì)胞克隆無(wú)能的影響

T細(xì)胞激活需要兩個(gè)信號(hào)的刺激：第一信號(hào)是形成的pMHC復(fù)合物被抗原遞呈細(xì)胞（APCs）遞呈給T細(xì)胞；第二信號(hào)通過(guò)T細(xì)胞與APCs表面的多對(duì)免疫分子結(jié)合，形成共刺激信號(hào)。當(dāng)T細(xì)胞缺乏第二信號(hào),其接觸抗原后無(wú)反應(yīng)性,形成了克隆無(wú)能狀態(tài)，從而產(chǎn)生特異性T細(xì)胞耐受?？寺o(wú)能組成外周免疫耐受的主要部分，也是避免自身免疫疾病的重要機(jī)制。APCs與共刺激分子的任何一個(gè)信號(hào)的缺乏都可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆無(wú)能，一些促進(jìn)T細(xì)胞的細(xì)胞因子（IL-2）的缺乏也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆無(wú)能。T細(xì)胞被誘導(dǎo)克隆無(wú)能后可以通過(guò)加入IL-2來(lái)恢復(fù)其增殖能力，因此，我們可以通過(guò)加入IL-2后其增殖能力恢復(fù)與否來(lái)判斷T細(xì)胞是否是被誘導(dǎo)克隆無(wú)能而影響其增殖能力。提取脾臟細(xì)胞，用尼龍毛過(guò)柱，提出T細(xì)胞，用ConA刺激T細(xì)胞增殖，在不同的孔加入梯度濃度的地磷莫斯（0，0.5，1 ng/mL），濃度為0.5 ng/mL的地磷莫斯沒(méi)有對(duì)T細(xì)胞的增殖沒(méi)有起到抑制作用,當(dāng)?shù)亓啄節(jié)舛冗_(dá)1 ng/mL時(shí)，T細(xì)胞的增殖被抑制，而加入IL-2之后，T細(xì)胞的增殖恢復(fù)。

由此得知,克隆無(wú)能是地磷莫斯對(duì)T細(xì)胞抑制的作用機(jī)制之一。

通過(guò)本課題的研究,我們證實(shí)地磷莫斯確實(shí)有免疫抑制作用，其抑制淋巴細(xì)胞的增殖，特別是T細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)誘導(dǎo)克隆無(wú)能等方法起到免疫抑制的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不是地磷莫斯起免疫抑制作用的方式。