董成亞，王伊龍，2，劉向榮

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）指包括位于腦實質(zhì)和蛛網(wǎng)膜下腔的所有血管結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，引起的腦實質(zhì)缺血或出血性損傷[1]。CSVD影像學(xué)上表現(xiàn)為腔隙病灶、腦白質(zhì)高信號、腦微出血、近期皮層下小梗死灶及腦萎縮等異常信號。其中，腦白質(zhì)高信號，即腦白質(zhì)彌漫性損害是CSVD的標志之一，臨床研究表明，腦白質(zhì)高信號常與患者認知功能下降乃至血管性癡呆有關(guān)[2-3]。合適的動物模型對CSVD相關(guān)腦白質(zhì)損傷的機制研究意義重大。本文主要描述具有腦白質(zhì)損傷的腦小血管病動物模型的建立，旨在為CSVD腦白質(zhì)損傷相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 單一型動物模型

1.1 雙側(cè)頸總動脈狹窄動物模型 通過手術(shù)在小鼠雙側(cè)頸總動脈周圍放置微彈簧圈可誘導(dǎo)慢性頸總動脈狹窄動物模型（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）。微彈簧圈的內(nèi)徑?jīng)Q定頸總動脈狹窄的嚴重程度，通常用于BCAS的微彈簧圈內(nèi)徑為0.16～0.2 mm，內(nèi)徑越小，腦血流下降速度越快，同時小鼠因頸總動脈急性收縮而死亡的比例越高[4]。BCAS能夠模擬人類因動脈管腔狹窄、慢性低灌注等因素導(dǎo)致的CSVD，但缺乏CSVD腦小血管病理學(xué)改變?nèi)缋w維素樣壞死、玻璃樣變、淀粉樣物質(zhì)沉積等。

使用內(nèi)徑0.18 mm微彈簧圈制作的小鼠BCAS模型，與術(shù)前基礎(chǔ)值相比，術(shù)后2 h小鼠腦血流量減少60%～70%，但1～3個月后腦血流量可恢復(fù)80%～85%。微彈簧圈對血壓無明顯影響。術(shù)后3 d，觀察到BCAS小鼠血腦屏障通透性增加[5]；術(shù)后14 d，可見胼胝體白質(zhì)空泡化，免疫組化染色顯示髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）丟失[6-7]。BCAS小鼠還可表現(xiàn)出小膠質(zhì)細胞活化和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2表達增加。有研究表明，MMP-2基因表達水平與腦白質(zhì)損傷的嚴重程度、血腦屏障破壞及神經(jīng)炎癥水平成正相關(guān)[8-9]。此外，隨著腦慢性低灌注時間延長，BCAS小鼠神經(jīng)功能評分顯著下降；術(shù)后6個月時，海馬葡萄糖利用明顯降低；8個月時，可見海馬萎縮并伴有細胞固縮和凋亡[10]。

1.2 雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型 雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型是通過手術(shù)在小鼠右側(cè)頸總動脈放置一個內(nèi)徑為0.5 mm的Ameroid慢性縮窄環(huán)，左側(cè)頸總動脈周圍放置一個微線圈（內(nèi)徑為0.18 mm），造成雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS）[11]。右側(cè)的Ameroid慢性縮窄環(huán)由于吸收周圍的組織液逐漸膨脹，導(dǎo)致被箍的右側(cè)頸總動脈逐漸狹窄，大約在術(shù)后28 d發(fā)生閉塞[11-12]。左側(cè)的微線圈則導(dǎo)致同側(cè)半球腦血流量降低，術(shù)后1周可達平臺期。ACAS模型在術(shù)后2周和4周，右側(cè)（放置Ameroid縮窄環(huán)）皮質(zhì)和皮層下腦血流量均低于左側(cè)半球腦血流量。該模型相對于BCAS模型，避免了動物因頸總動脈急性收縮造成的死亡率過高問題，但同樣缺乏CSVD腦小血管病理學(xué)改變。

ACAS模型中，左側(cè)（放置微線圈）腦部血流量減少較輕，可見明顯的白質(zhì)疏松和膠質(zhì)細胞增多；在右頸總動脈縮窄環(huán)側(cè)，組織病理學(xué)檢測也發(fā)現(xiàn)有海馬區(qū)的小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)元丟失[13]。有文獻報道，在右側(cè)皮層下區(qū)域，包括深部白質(zhì)和海馬區(qū)可見多發(fā)性梗死[13-14]。此外，通過Y迷宮測試，發(fā)現(xiàn)ACAS小鼠空間工作記憶和自發(fā)活動受損明顯，術(shù)后28 d可出現(xiàn)認知功能障礙[11]。因此，ACAS適用于CSVD中出現(xiàn)的腦白質(zhì)梗死并伴有運動缺陷和癡呆的動物模型的行為學(xué)評估。

1.3 腦淀粉樣血管病模型 腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）是指在大腦和軟腦膜血管壁出現(xiàn)淀粉樣纖維沉積，主要是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），導(dǎo)致繼發(fā)性血管退行性改變[15]。CAA主要表現(xiàn)為皮質(zhì)微出血相關(guān)的白質(zhì)改變和進展性癡呆，是與年齡老化相關(guān)的一種腦血管病[16]。該模型適合于因Aβ沉積引起的CSVD中血管病變和腦白質(zhì)損害的發(fā)生機制研究。

CAA表型相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型主要通過基因調(diào)控淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），引起Aβ合成增加或發(fā)生突變。其中，一類是散發(fā)性CAA動物模型，如野生型過表達Aβ的APP Swedish小鼠（APP/Sw，Tg2576和APP23小鼠）易發(fā)生腦淀粉樣血管病[17-18]。另一類動物模型可模擬遺傳性CAA，如Dutch APP小鼠是APP中E693Q基因位點突變所致，該模型小鼠主要表現(xiàn)為腦血管病理改變，在腦實質(zhì)中幾乎不存在淀粉樣蛋白，伴發(fā)血管肌細胞變性、腦血管淀粉樣變、神經(jīng)炎癥和出血[19]。同樣，Aβ中Dutch E22Q和Iowa D23N基因突變導(dǎo)致遺傳性CAA，伴發(fā)大量淀粉樣斑塊沉積[20]。而含有Swedish K670N/M6711和血管性Dutch/Iowa E693Q/D694基因突變的Tg-SwDI小鼠，僅在大腦血管表現(xiàn)出纖維性Aβ沉積，該模型小鼠有腦小血管淀粉樣變、腦白質(zhì)病變及明顯的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，包括腦血管密度降低、腦血管細胞凋亡及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增多和小膠質(zhì)細胞活化[21-22]。

1.4 Notch3轉(zhuǎn)基因小鼠模型 伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一種由Notch3基因突變造成的單基因遺傳性腦小血管病[23]。該模型的特征性病理變化是在電鏡下可觀察到中小動脈平滑肌細胞表面有嗜鋨顆粒（granular osmiophilic material，GOM）沉積，導(dǎo)致中小動脈退行性變和腦血流量下降[24]。CADASIL發(fā)病由Notch3單基因突變所致，Notch3是在成熟動脈血管壁肌細胞中發(fā)現(xiàn)的一種大的跨膜受體。CADASIL Notch3轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以模擬非高血壓缺血性CSVD的遺傳現(xiàn)象。

文獻報道有兩種CADASIL相關(guān)表型的基因工程小鼠模型，它們都是模擬患者中Notch3基因Arg169Cys位點替換導(dǎo)致的CADASIL。其中一種轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶表達Notch3類似物的人工染色體，可導(dǎo)致Notch3的R169C點突變[25-26]。5月齡Notch3R169C小鼠開始出現(xiàn)GOM沉積，12月齡開始出現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞增生，18～20月齡小鼠胼胝體、紋狀體、內(nèi)囊和海馬出現(xiàn)廣泛的腦白質(zhì)病變[25]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，Notch3R169C小鼠的腦白質(zhì)早期病變呈進行性和節(jié)段性，以髓鞘內(nèi)微泡形成（直徑＜1 μm）和水腫為主，與局灶性髓磷脂降解有關(guān)；同時，在腦白質(zhì)病變部位發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞清除髓鞘碎片的能力下降[27]。

另一種CADASIL小鼠模型是利用基因敲入系統(tǒng)將正常小鼠Notch基因替代為Notch3Arg170Cys，即Notch3基因的等位突變[28]。此方法構(gòu)建的Notch3Arg170Cys株小鼠在9月齡時開始出現(xiàn)GOM沉積，之后，出現(xiàn)一些卒中樣病變的癥狀。Notch3Arg170Cys株小鼠的大腦動脈和外周動脈（如尾動脈）均可發(fā)生退行性病變。組織病理學(xué)分析顯示，該模型存在微出血、血栓形成、纖維膠質(zhì)細胞增多癥和微梗死。此外，在有些個體中，自13月齡起小鼠運動功能發(fā)生障礙，主要表現(xiàn)為肢體輕癱和步態(tài)不穩(wěn)[29]。

1.5 自發(fā)性高血壓大鼠模型及易卒中亞型大鼠模型 自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是對成年高血壓Wistar大鼠進行培育而獲得的[30]。SHR能夠模擬臨床患者高血壓引起的CSVD早期發(fā)病階段。而自發(fā)性高血壓易卒中大鼠（spontaneously hypertensive stroke-prone rats，SHRSP）是在SHR基礎(chǔ)上培育出的亞系，壽命較SHR短，卒中發(fā)生率高達80%以上。組織病理學(xué)證實，SHRSP的血管病變與人類CSVD類似，是目前較理想的CSVD模型[31]。但是，SHR及其易卒中亞型均缺乏嚴格的正常血壓對照，使得SHR和SHRSP在高血壓遺傳背景相關(guān)研究中受到限制[32]。

Daniel Kaiser等[33]對比研究了SHR和非高血壓Wistar Kyoto（WKY）大鼠認知功能和神經(jīng)炎癥，發(fā)現(xiàn)在SHR生命里的前三分之一即存在血腦屏障功能受損、腦白質(zhì)損傷和小膠質(zhì)細胞活化。SHR還表現(xiàn)為全腦萎縮、皮層下病變、皮層梗死出血，血管周圍間隙增大等[34]。該模型可表現(xiàn)出與腦白質(zhì)損傷有關(guān)的空間工作記憶和注意力等執(zhí)行功能缺陷，以及由于腦容量減少而導(dǎo)致的運動障礙[35]。相比較SHR，SHRSP中腦白質(zhì)病變更為常見，且隨著鼠齡的增長白質(zhì)損傷范圍增大，20周齡時，胼胝體、內(nèi)囊和尾狀核出現(xiàn)早期白質(zhì)病變；24周時，白質(zhì)疏松呈囊狀，尤其是在富含有髓纖維的內(nèi)囊區(qū)，可見明顯的空泡形成[36]。

1.6 易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型 易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRSP）是我國學(xué)者曾進勝應(yīng)用內(nèi)徑為0.3 mm的銀夾夾閉雙側(cè)腎動脈誘導(dǎo)的穩(wěn)定高血壓大鼠模型[37]。SD大鼠在行雙腎雙夾術(shù)后血壓緩慢升高，至12周達到峰值，此后維持在200 mm Hg左右。該模型能夠模擬CSVD高危因素高血壓及相應(yīng)的腦小血管病理學(xué)改變。

RHRSP表現(xiàn)出的腦白質(zhì)病變與人類慢性高血壓性腦白質(zhì)病變發(fā)病過程相似。病理染色顯示腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細胞增生、神經(jīng)纖維纏結(jié)或缺失。其中，病變最明顯的部位在胼胝體。腦小血管HE染色可見小血管玻璃樣變、管壁結(jié)構(gòu)消失和管腔狹窄。此外，在RHRSP中可觀察到血腦屏障破壞及大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力下降[38]。

1.7 高血壓靈長類動物模型 非人類靈長類動物有著較大的多腦回大腦、豐富的腦白質(zhì)，以及與人類認知類似的復(fù)雜行為，是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域非常珍貴的一種實驗物種[39]。有學(xué)者以獼猴為實驗對象，成功建立胸主動脈狹窄所致高血壓模型猴，其神經(jīng)病理學(xué)上最主要的損傷是：形狀不規(guī)則的微梗死（直徑＜500 μm），伴有局部膠質(zhì)細胞增生，散布于大腦皮層灰質(zhì)和白質(zhì)、腦干及小腦，尤其是前額葉白質(zhì)[40]。在該模型猴中，除局部小膠質(zhì)細胞活化外，未見其他血管病變。在手術(shù)后12個月左右，出現(xiàn)認知功能下降[41]。動物認知功能障礙的嚴重程度與收縮壓和舒張壓的升高有關(guān)。

2 復(fù)合型動物模型

2.1 自發(fā)性高血壓大鼠/雙側(cè)頸總動脈漸進性狹窄模型 Akihiro Kitamura等[42]將Ameroid收縮環(huán)套在自發(fā)性高血壓大鼠左、右側(cè)頸總動脈上，造成雙側(cè)頸動脈逐漸閉塞的慢性高血壓伴發(fā)腦灌注不足CSVD動物模型（SHRs subjected to the bilateral CCA gradual occlusion，SHR-2VGO）。術(shù)后7 d，SHR-2VGO大鼠腦血流逐漸下降，達到基線水平的68%。術(shù)后28 d，SHR-2VGO大鼠表現(xiàn)出緩慢進展的腦白質(zhì)病變和空間工作記憶受損；組織染色顯示腦白質(zhì)中有脫髓鞘改變、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增多。該模型克服了同時結(jié)扎雙側(cè)頸動脈出現(xiàn)的腦血流急劇下降導(dǎo)致的死亡率過高的問題，能夠較好地模擬CSVD中高血壓和慢性腦低灌注引起的腦小血管病理學(xué)改變和白質(zhì)損傷。

2.2 易卒中型腎性高血壓大鼠/改良的雙側(cè)頸總動脈狹窄動物模型 林晶等[43]通過先行雙腎雙夾術(shù)制作RHRSP模型，12周后間隔1周先后進行雙側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)，制作易卒中型腎性高血壓大鼠/改良的2VO模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat/modified 2 vessel occlusion，RHRSP/Modified 2VO）。RHRSP/Modified 2VO具有高血壓及腦小血管病理改變，能較好地模擬CSVD腦白質(zhì)病理改變。術(shù)后12周，RHRSP/Modified 2VO表現(xiàn)出腦小動脈管壁增厚、血腦屏障破壞，免疫組化染色顯示I型和IV型膠原沉積在腦小靜脈[44]。此外，RHRSP/Modified 2VO大鼠還表現(xiàn)出髓磷脂堿性蛋白表達減少和腦白質(zhì)損傷分級增加，Morries水迷宮測試中出現(xiàn)明顯空間記憶功能受損[43]。

2.3 高脂血癥/雙側(cè)頸總動脈狹窄動物模型Eek-Sung Lee等[45]在載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠雙側(cè)頸總動脈周圍放置微彈簧圈，建立高脂血癥合并慢性頸總動脈狹窄動物模型。造模后，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠有腦白質(zhì)損傷、多發(fā)性微梗死和星形膠質(zhì)細胞增生；腦微循環(huán)研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠腦微血管密度下降，血腦屏障破壞；此外，曠場實驗和迷宮實驗發(fā)現(xiàn)該模型動物空間工作記憶和自發(fā)運動功能下降，認知功能也明顯受損。該小鼠動物模型可用于探究高脂血癥引起的慢性低灌注性CSVD的發(fā)病機制及治療靶點。

具有白質(zhì)損傷的腦小血管病動物模型不僅可以用來研究白質(zhì)改變和CSVD之間的關(guān)系，而且也可用來研究不同發(fā)病機制、治療藥物與CSVD疾病嚴重程度之間的關(guān)系，對于疾病的預(yù)防、診斷及治療有著重要的作用。動物模型制作的方法多樣，沒有統(tǒng)一的衡量標準，各種不同模型制備方法也各有其優(yōu)缺點，需要根據(jù)不同的研究目的來選擇和制備合適的CSVD動物模型。

【點睛】本文總結(jié)了經(jīng)由頸總動脈狹窄、高血壓、腦淀粉樣血管病、Notch3轉(zhuǎn)基因等方法建立腦小血管病白質(zhì)損傷動物模型制作的方法及其在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。