徐國超，高 巖，馬 爽，賈勝男，邱 晴，王 鈺，霍洪亮

(1.長春市職業(yè)技術(shù)學院基礎(chǔ)教育學部，吉林 長春 130033；2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024；3.東北師范大學環(huán)境學院，吉林 長春 130117)

骨骼肌是構(gòu)成人體結(jié)構(gòu)的重要組成部分，具有維持軀體姿勢、產(chǎn)生軀體運動和參與能量代謝等多種生理功能[1-3].在軀體運動過程中或者某些病理條件下，骨骼肌容易受到損傷或者產(chǎn)生代謝障礙[4-5].骨骼肌屬于終末分化細胞，不能進行補償性增殖，損傷后只能通過蛋白質(zhì)合成調(diào)控和骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化進行修復[6-7].人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，[8-9]具有抗癌、抗輻射和抗衰老等功能[10].有關(guān)人參皂苷Rg1對骨骼肌發(fā)育、增殖和分化調(diào)控作用的報道較少.為此，本文探討了人參皂苷Rg1對骨骼肌增殖、分化的影響，本研究對開展受損骨骼肌治療與修復，提高骨骼肌機能具有重要的臨床意義.

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；胰蛋白酶(北京鼎國生物公司)；胰島素樣生長因子-1(IGF-1，武漢艾美捷公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Cat#P1200，北京索萊寶生物公司)；單克隆抗兔MyoG抗體(英國Abcam公司)，單克隆抗鼠MyHC抗體(英國Abcam公司)，單克隆抗鼠β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物公司)；二甲基亞砜(DMSO，北京鼎國生物公司)；人參皂苷Rg1(上海源葉生物公司)；細胞活性測定試劑盒(美國Sigma公司).

1.2 細胞系

小鼠骨骼肌成肌細胞系C2C12細胞 (美國模式菌種收集中心).

1.3 噻唑藍比色法(MTT)

收集C2C12細胞，按照10 000個/mL的密度取200 μL接種于96孔板內(nèi)，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞完全貼壁后，棄掉細胞培養(yǎng)液，更換無血清培養(yǎng)基處理12 h.按照空白組、不同濃度人參皂苷Rg1組分別處理48 h，加入20 mL 0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h.每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min.待MTT-甲臜結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測D(490)值.

1.4 流式細胞術(shù)

C2C12細胞按1 000 000個/mL的密度接種于6孔板中，細胞完全貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h.按空白組、IGF-1處理組和人參皂苷Rg1處理組培養(yǎng)48 h，加入EDU試劑(10 μmol/L)處理4 h.按照EDU檢測試劑盒說明，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液洗滌細胞.用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞.用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液重懸細胞，室溫避光孵育15 min.用含1% BSA的PBS緩沖液再洗滌細胞，收集細胞加入EDU反應(yīng)混合物中，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測.

1.5 蛋白質(zhì)印跡法

將C2C12細胞超聲破碎，分別加入磷酸酶抑制劑A和B，4℃條件下16 000 r/min離心10 min.吸取上清100 μL移至EP管中，加入等量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液.沸水煮蛋白樣品5～10 min，使蛋白變性.上樣，120 V電泳30 min.取出凝膠，蒸餾水沖洗.取與凝膠大小相同的PVDF膜，在甲醇中潤濕，以1張海綿、3張濾紙、凝膠、1張PVDF膜、3張濾紙、1張海綿平放并夾緊，置于冰盒中，加入冷轉(zhuǎn)膜液800 mL，連通電泳儀，100 V恒壓處理1 h.轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后，將PVDF膜放入封閉液中，4℃封閉過夜.封閉過后的PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，加一抗孵育2 h.TBST漂洗3次，加二抗，孵育1 h.用TBST漂洗3次.將印跡膜蛋白在全自動顯影儀中顯影.利用Image Pro Plus6.0軟件進行半定量分析.

2 實驗結(jié)果

2.1 細胞活性

人參皂苷Rg1孵育C2C12細胞48 h后，用10×20倍顯微鏡觀察、拍照，結(jié)果見圖1.由圖1可見，與空白組相比人參皂苷Rg1處理組細胞明顯增多.利用MTT比色法檢測細胞活力，結(jié)果見圖2，與空白組相比人參皂苷Rg1處理組D(490)值呈濃度依賴性增加，并在濃度為0.01 mmol/L時達到最高，表明人參皂苷Rg1能夠促進C2C12增長并提高其活性.

a空白；b—e分別為0.0001，0.001，0.01和0.1 mmol/L人參皂苷Rg1處理，下同

圖2 MTT比色法檢測細胞活性

2.2 細胞增殖率

胰島素樣生長因子(IGF-1)對成肌細胞具有良好的促增殖作用.以IGF-1作為陽性對照，用0.01 mmol/L 人參皂苷Rg1孵育C2C12細胞48 h，流式細胞術(shù)檢測C2C12細胞的增殖率，結(jié)果見圖3.與空白組比較可見，人參皂苷Rg1處理組C2C12細胞的增殖率明顯升高，并且已接近IGF-1組，表明人參皂苷Rg1能夠顯著提高C2C12細胞的增殖率.

2.3 細胞分化

用人參皂苷Rg1孵育C2C12細胞，并用2%馬血清誘導細胞分化，培養(yǎng)5 d后利用10×20倍顯微鏡進行觀察、拍照，結(jié)果見圖4.與空白組比較可見，人參皂苷Rg1處理組細胞明顯變長，細胞纖維化程度增強，細胞排列更加整齊，生長更具有方向性.對細胞長度進行測量后發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1對C2C12細胞長度的增加呈濃度依賴性，表明人參皂苷Rg1能夠促進C2C12細胞的分化.

圖3 人參皂苷Rg1對C2C12細胞增殖率的影響

圖4 人參皂苷Rg1對C2C12細胞分化的影響

2.4 肌球蛋白重鏈(MyHC)表達

為進一步驗證人參皂苷Rg1促進C2C12細胞分化的功能，將C2C12細胞用2%馬血清誘導，人參皂苷Rg1分別孵育3，5，7 d后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測MyHC的表達情況，結(jié)果見圖5.由圖5可見，人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性地提高C2C12細胞MyHC的表達量，0.01 mmol/L處理組效果最好.這種促進效應(yīng)可以持續(xù)7 d以上，第7天MyHC相對表達量最高，說明在一定時間內(nèi)，隨著人參皂苷Rg1孵育天數(shù)的增多，對細胞MyHC表達的促進作用也逐漸增強.表明人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性、時間依賴性地促進C2C12細胞終末分化標志蛋白MyHC的表達，證明了人參皂苷Rg1對C2C12細胞的促分化作用.

圖5 人參皂苷Rg1對C2C12細胞肌球蛋白重鏈MyHC表達的影響

2.5 肌細胞生成素(MyoG)表達

骨骼肌成肌細胞分化受多種成肌分化因子調(diào)節(jié)[11]，其中MyoG在骨骼肌分化的后期起著關(guān)鍵性的作用，常用于骨骼肌分化標志物的檢測[12-13].人參皂苷Rg1分別孵育C2C12細胞3，5，7 d后，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測MyoG的表達水平，結(jié)果見圖6.由圖6可見，人參皂苷Rg1處理后MyoG表達水平都有不同程度的升高，且具有濃度依賴性.其中0.01 mmol/L處理組在不同時間梯度中MyoG相對表達量最好，分別是空白組的1.83，2.14和2.2倍.由此可見，人參皂苷Rg1能夠上調(diào)MyoG表達，再次證明Rg1對C2C12具有促進分化的作用.

圖6 人參皂苷Rg1對C2C12細胞中肌細胞生成素MyoG蛋白表達的影響

3 結(jié)論

骨骼肌是人體動力產(chǎn)生器官，不論是廢用性萎縮、衰老，還是病理性肌萎縮，都會對患者的生活質(zhì)量造成極大的影響.目前，許多學者致力于研究安全有效的治療骨骼肌損傷的方法，其中，天然、無副作用的生物藥物越來越受到學者的關(guān)注.人參的抗腫瘤、抗氧化和保護心血管的作用已經(jīng)被人們所認識.人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，在增強學習記憶和神經(jīng)保護等方面都具有明顯的功效.

本文的研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1對小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12的增殖與分化均具有良好的促進作用.細胞計數(shù)結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1孵育的C2C12細胞數(shù)目明顯增多.細胞活力檢測表明，C2C12細胞活性與人參皂苷Rg1呈濃度依賴性增加，人參皂苷Rg1對提高C2C12細胞活力有促進作用.人參皂苷Rg1對C2C12細胞增殖率的影響也很顯著，接近于胰島素樣生長因子-1.

成人骨骼肌損傷修復是一個高度同步化的過程，成肌細胞經(jīng)過增殖、分化和融合形成新的肌纖維并重構(gòu)收縮功能.其中，成肌細胞分化為可收縮的肌纖維是一個非常重要環(huán)節(jié).成肌細胞分化受多種生肌調(diào)節(jié)因子調(diào)控，而肌細胞生成素(MyoG)是一個重要的促分化因子，在肌分化的早期參與正常肌管的形成.C2C12細胞經(jīng)人參皂苷Rg1孵育后，MyoG的表達明顯上調(diào)，對啟動成肌細胞分化具有重要作用.肌球蛋白重鏈(MyHC)是成肌細胞分化末期的標志性蛋白，人參皂苷Rg1能夠呈濃度依賴性地增加MyHC的表達水平，促進了骨骼肌成肌細胞C2C12的分化.這些結(jié)果表明，利用人參皂苷Rg1孵育C2C12細胞，既能促進細胞增殖、提高細胞活力，還能促進細胞分化.本研究為骨骼肌受損后治療與修復提供了一個新的靶點，也為如何提高運動人員的骨骼肌機能提供了新的思路和方法.