■楊 剛 楊國浩 管軍軍 尹清強(qiáng)

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002）

羽毛粉蛋白質(zhì)含量豐富[1]，但其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于水，不能被一般的蛋白酶水解，難以被動物消化吸收。隨著飼料蛋白資源的日益短缺和價格飛速上漲，利用微生物的作用，將羽毛角蛋白進(jìn)行降解，既可節(jié)省能源、保護(hù)環(huán)境，還可得到優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白原料產(chǎn)品[2-3]。本試驗(yàn)選取可用于降解羽毛粉的米曲霉和枯草芽孢桿菌菌株，對其降解羽毛粉的效果進(jìn)行分析和比較，為羽毛粉的生物降解和營養(yǎng)價值提升研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羽毛粉和麩皮由河南德鄰生物制品有限公司提供，產(chǎn)蛋白酶的米曲霉（Aspergililus oryzae）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與動物營養(yǎng)研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 羽毛粉培養(yǎng)基Ⅰ

羽毛粉2 g、葡萄糖2 g、氯化鈉0.5 g、氯化鈣0.05 g、氯化鋅0.1 g、水 90 ml。

1.2.2 羽毛粉培養(yǎng)基Ⅱ

羽毛粉9 g、麩皮1 g、氯化鈣0.05 g、氯化鋅0.1 g、水8 ml。

所有培養(yǎng)基均需在121℃和1×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉和枯草芽孢桿菌在羽毛粉培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶活力測定

枯草芽孢桿菌接種于羽毛粉培養(yǎng)基Ⅰ中，37℃振蕩培養(yǎng)72 h后，3 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，測定酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力。米曲霉接種于羽毛粉培養(yǎng)基Ⅱ中，30℃靜置培養(yǎng)72 h，加入100 ml滅菌生理鹽水，靜置30 min后過濾，得到上清液，測定酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力。每個試驗(yàn)3個重復(fù)。

蛋白酶活力測定按照GB/T 23527—2009方法執(zhí)行（下同）。蛋白酶活力單位定義為每克固體酶粉或每毫升液體酶，在1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸，即為一個蛋白酶活力單位，以U/g（U/ml）表示。

1.3.2 米曲霉和枯草芽孢桿菌對羽毛粉的降解效果

將米曲霉孢子接種于高壓滅菌處理的羽毛粉培養(yǎng)基Ⅱ中，30 ℃靜置培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h和120 h取樣，制取上清液，測定中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量。每個試驗(yàn)變量3個重復(fù)。

將枯草芽孢桿菌接種于高壓滅菌處理的羽毛粉培養(yǎng)基Ⅰ中，37℃振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h取樣，離心取上清液，測定中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量。每個試驗(yàn)變量3個重復(fù)。

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[4]測定。

1.3.3 米曲霉發(fā)酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝膠電泳檢測

依照尚宏麗等[5]方法進(jìn)行電泳檢測：配制15%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣15 μl進(jìn)行電泳，濃縮膠中以80 V電壓電泳，待樣品通過濃縮膠之后，調(diào)高電壓至120 V直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色過夜，脫色用考馬斯亮藍(lán)脫色液直至脫色完全。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉和枯草芽孢桿菌在羽毛粉培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶活力(見表1)

表1 米曲霉和枯草芽孢桿菌在羽毛粉培養(yǎng)基中蛋白酶活力測定

從表1可以看出，在羽毛粉作為唯一氮源的培養(yǎng)基中，米曲霉和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶活力顯著高于酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活力，其中酸性蛋白酶活力最低（P＜0.05），因而后續(xù)試驗(yàn)以中性蛋白酶活力作為測定指標(biāo)。

2.2 米曲霉和枯草芽孢桿菌對羽毛粉降解效果

表2 米曲霉發(fā)酵羽毛粉不同時間中性蛋白酶活力測定

表2為米曲霉接種到羽毛粉培養(yǎng)基中時，不同時間中性蛋白酶活力的測定結(jié)果。從表2可以看出，米曲霉發(fā)酵羽毛粉時，分泌的蛋白酶活力在72 h前隨時間延長而快速升高，在72 h達(dá)到最大值，之后緩慢下降，72 h時蛋白酶活力達(dá)到3 256.61 U/g，與其他時間蛋白酶活力測定結(jié)果差異顯著（P＜0.05）。

表3 米曲霉發(fā)酵羽毛粉不同時間可溶性蛋白含量測定

表3為不同時間米曲霉發(fā)酵羽毛粉的可溶性蛋白含量的變化。由表3可以看出，在米曲霉發(fā)酵羽毛粉時，羽毛粉可溶性蛋白含量在培養(yǎng)初期顯著提高，在48 h時達(dá)到最高值（362.07 mg/g），與其余時間可溶性蛋白含量差異顯著（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵羽毛粉不同時間中性蛋白酶活力

表5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵羽毛粉不同時間可溶性蛋白含量測定

表4和表5為枯草芽孢桿菌發(fā)酵羽毛粉時，中性蛋白酶活力和可溶性蛋白含量的變化情況。從表中可以看出，枯草芽孢桿菌發(fā)酵羽毛粉時，分泌的蛋白酶酶活力在72 h達(dá)到最大（690.03 U/g）；而羽毛粉可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，48 h以后差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 米曲霉發(fā)酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝膠電泳

對米曲霉發(fā)酵羽毛粉的可溶性蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，48 h時羽毛粉中可溶性蛋白含量達(dá)到最高，之后快速下降。72 h之后有明顯的蛋白酶條帶。

圖1 羽毛粉可溶性蛋白的SDS-PAGE蛋白凝膠電泳

3 討論

3.1 羽毛粉降解菌產(chǎn)蛋白酶種類

本試驗(yàn)對篩選出的米曲霉和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力進(jìn)行測定，兩種菌在羽毛粉培養(yǎng)基中生成的中性蛋白酶活力顯著高于酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活力（P＜0.05），而且堿性蛋白酶活力顯著高于酸性蛋白酶活力（P＜0.05），說明在以羽毛粉為唯一氮源和誘導(dǎo)物情況下，米曲霉和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主，與之前的研究結(jié)果一致[6]。

3.2 米曲霉和枯草芽孢桿菌對羽毛粉的降解效果

本試驗(yàn)將米曲霉或枯草芽孢桿菌接種在以羽毛粉為唯一氮源的培養(yǎng)基中，以蛋白酶活力和可溶性蛋白含量為指標(biāo)，研究米曲霉和枯草芽孢桿菌對羽毛粉的降解效果。蛋白酶活力的升高表明微生物可以有效利用羽毛粉作為氮源生長，并分泌蛋白酶對羽毛粉進(jìn)行降解?？扇苄缘鞍缀康奶岣弑砻饔鹈墼谖⑸镒饔孟?，羽毛粉中的肽鍵被分泌的蛋白酶破壞，蛋白質(zhì)被逐步降解為小分子量蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)中，米曲霉分泌的蛋白酶活力最高可達(dá)3 256.61 U/g，枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最高可達(dá)690.03 U/g，表明兩種微生物均可以有效降解羽毛粉，利用羽毛粉作為氮源生長。

米曲霉發(fā)酵羽毛粉時，可溶性蛋白含量由最初的2.21 mg/g提高到48 h的362.07 mg/g，表明在米曲霉作用下，羽毛粉中有36%左右的角蛋白被降解為可溶性蛋白，可以更好地被動物消化吸收?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵羽毛粉時，48 h時可溶性蛋白含量為11.45 mg/g，96 h時可溶性蛋白含量最高達(dá)到12.04 mg/g，與48 h之前相比差異顯著(P＜0.05)，但48 h以后可溶性蛋白含量變化不大。從米曲霉和枯草芽孢桿菌對羽毛粉降解的試驗(yàn)結(jié)果來看，兩種微生物均可以對羽毛粉起到一定的降解作用，其中米曲霉的降解效果更為明顯。

3.3 米曲霉發(fā)酵羽毛粉上清液的SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE電泳結(jié)果說明，米曲霉發(fā)酵羽毛粉時，24 h時羽毛粉中可溶性蛋白含量較低，表明羽毛粉蛋白質(zhì)主要以角蛋白形式存在，且不溶于水，48 h時羽毛粉中可溶性蛋白含量顯著升高，表明米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶開始降解羽毛粉，羽毛粉角蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，水溶性提高，隨著蛋白酶的增加，蛋白酶將羽毛粉中大分子蛋白進(jìn)一步降解為小分子蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸，48 h后羽毛粉中大分子蛋白含量明顯降低。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明米曲霉和枯草芽孢桿菌均可以對羽毛粉角蛋白進(jìn)行降解，最佳發(fā)酵時間為72 h，此時米曲霉發(fā)酵羽毛粉蛋白酶酶活力達(dá)到3 256.61 U/g，枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶活力最高可達(dá)690.03 U/g，兩者之中米曲霉對羽毛粉的降解效果較好。