金 磊,王立志,谷 可,王之盛,薛 白,彭全輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都 611130)

磷是影響動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育的一種重要的常量礦物元素。幼齡動(dòng)物缺乏磷會(huì)出現(xiàn)佝僂病，而成年動(dòng)物缺乏磷會(huì)出現(xiàn)軟骨?。淮送?，磷還參與了動(dòng)物體內(nèi)氨基酸、脂類(lèi)和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝[1-3]。同時(shí)，磷也是一種價(jià)格較為昂貴的飼料原料[4]。研究發(fā)現(xiàn)，植物性飼料中的磷由于受到植酸的束縛，并不能被動(dòng)物胃腸道完全消化吸收，未消化的磷主要以糞便的形式排放到體外，然后滲透到地表以及水體中，最終造成極其嚴(yán)重的環(huán)境污染[5]。因此，提高動(dòng)物對(duì)飼料磷的消化利用效率，不但能降低動(dòng)物的養(yǎng)殖成本，而且對(duì)減少環(huán)境污染也具有非常重要的意義。與單胃動(dòng)物相比，反芻動(dòng)物對(duì)植物性飼料中所含的磷具有較高的消化率。這主要是因?yàn)榉雌c動(dòng)物擁有特殊的瘤胃器官，其中共生的微生物能夠分泌大量的植酸酶，微生物植酸酶通過(guò)催化植酸水解，釋放出其中所含的磷，從而促進(jìn)宿主對(duì)飼料磷的消化[6]。

迄今為止，雖然已有許多關(guān)于瘤胃微生物結(jié)構(gòu)和組成的研究報(bào)道[7-8]。但是人們對(duì)于瘤胃中能分泌植酸酶的微生物了解的并不太多，飼料磷的消化率與瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與組成關(guān)系仍未知[9]。針對(duì)這些問(wèn)題，本研究以山羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)消化試驗(yàn)篩選出飼料磷消化率不同的群體，然后采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)比較不同磷消化率的山羊瘤胃微生物結(jié)構(gòu)與組成的差異。研究結(jié)果將促進(jìn)人們更清晰地認(rèn)識(shí)瘤胃微生物與宿主磷消化率之間的關(guān)系，為通過(guò)調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系來(lái)提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料磷的利用效率，以及植酸酶高產(chǎn)菌株的篩選等提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

選取28只10月齡，雌性，平均體重為(24.25±2.47)kg的努比亞黑山羊作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，整個(gè)試驗(yàn)期山羊單籠飼養(yǎng)，每日飼喂量(干物質(zhì))按體重的3.5%供給，自由飲水。參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816-2004)，以每天每頭增重 0.1 kg為標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平詳見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

為了滿足使用差量法計(jì)算山羊飼料磷真消化率的條件，整個(gè)試驗(yàn)由兩個(gè)時(shí)期(I期和II期)組成，每個(gè)試驗(yàn)期由14 d預(yù)飼期和6 d消化試驗(yàn)期組成，每期20 d，共40 d。II期試驗(yàn)與I期試驗(yàn)相比，額外添加磷酸氫鈣來(lái)提高日糧磷的含量。兩期消化試驗(yàn)期間，每日收集山羊排泄的全部糞便，取糞便總量的10%，用10%鹽酸固氮后貯存于-20 ℃。根據(jù)兩期山羊的采食量和糞便排泄量，然后通過(guò)釩鉬酸銨比色法測(cè)定飼料和糞便樣品中的磷含量，采用差量法計(jì)算山羊?qū)︼暳狭椎恼嫦省Ｔ囼?yàn)結(jié)束的次日晨飼前2 h對(duì)每只山羊靜脈采血20 mL，靜置 30 min 后，4 000 r·min-1離心10 min，分離出血清，分裝于1.5 mL 的離心管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蟛捎梦腹芊ǔ槿∩窖蛄鑫竷?nèi)容物，主要過(guò)程：將 10 mm直徑聚氯乙烯管連接到一個(gè)真空泵(7 mbar)，用開(kāi)口器打開(kāi)羊的口腔，將聚氯乙烯管從羊口腔緩慢插入，直至瘤胃。打開(kāi)真空泵電源，抽取瘤胃內(nèi)容物，棄去混入大量唾液的初始瘤胃內(nèi)容物，然后再抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL裝入充滿氮?dú)獾臉悠反?，置于冰上。反?fù)拍打樣品袋以確保固相微生物充分進(jìn)入液相，然后用4層紗布過(guò)濾得到瘤胃液。迅速用pH計(jì)測(cè)定瘤胃液的pH[10]，最后將瘤胃液編號(hào)分裝后貯存于-80 ℃，用于后期測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸和提取微生物總DNA。

采用差量法計(jì)算公式計(jì)算28只山羊個(gè)體對(duì)飼料磷的真消化率：

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.預(yù)混料是由同一類(lèi)的多種添加劑或不同類(lèi)的多種添加劑按一定配比制作而成的勻質(zhì)混和物，預(yù)混料為每千克日糧提供：VA 2 937 IU, VD 343 IU, VE 30 IU，F(xiàn)e(FeSO4) 30 mg, Cu (CuSO4) 10 mg, Zn (ZnSO4) 50 mg, Mn (MnSO4) 60 mg;2. 營(yíng)養(yǎng)水平是指日糧中營(yíng)養(yǎng)成分的含量，代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值

1.Premix is a homogeneous mixture made from a variety of additives of the same class or a variety of additives of different kinds according to a certain proportion, premix provides the following per kg of the diet: VA 2 937 IU, VD 343 IU, VE 30 IU, Fe (as ferrous sulfate) 30 mg, Cu (as copper sulfate) 10 mg, Zn (as zinc sulfate) 50 mg, Mn (as manganese sulfate) 60 mg;2. Nutrient level refers to the content of nutrients in the diet, ME is a calculated value and others are measured values

統(tǒng)計(jì)28只山羊?qū)︼暳狭渍嫦实钠骄导皹?biāo)準(zhǔn)差，將磷真消化率大于群體平均值+0.5倍標(biāo)準(zhǔn)差的山羊作為高磷真消化率組(high true digestibility of phosphorus，HP)，磷真消化率小于群體平均值-0.5倍標(biāo)準(zhǔn)差的山羊作為低磷真消化率組(low true digestibility of phosphorus，LP)。

1.3 瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量測(cè)定、微生物DNA提取和PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序

分別取各樣品瘤胃液5 mL，按偏磷酸與瘤胃液1∶5的比例加入25%偏磷酸溶液，4 ℃ 20 000 r·min-1離心10 min，取上清液運(yùn)用氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸總量和各酸的含量[12]。

采用前人描述的方法提取和純化HP組和LP組山羊瘤胃液微生物總DNA[13]，主要過(guò)程為用細(xì)菌通用引物對(duì):515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，此處的M是簡(jiǎn)并堿基)和806R (5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′，此處的V、S是簡(jiǎn)并堿基)，以瘤胃內(nèi)容物菌群總DNA為模板，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)用PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：5 U·μL-1Taq酶0.25 μL，10×Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL，10 μmol·L-1引物各1.25 μL，50 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用PCR純化試劑盒純化和回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST fluorometer定量。送北京諾禾致源有限公司構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)依次用QIIME 1.8.0軟件質(zhì)控、Mothur 軟件拼接，并進(jìn)行Tags過(guò)濾和剔除嵌合體[14-16]。然后使用Uclust[17]聚類(lèi)算法將序列聚類(lèi)為OTU (operational taxonomic units)，并使用RDF分類(lèi)器對(duì)OTU的代表序列從門(mén)到屬進(jìn)行物種注釋?；贠TU table和rep_set. tree文件及抽樣的最大深度，繪制OTU稀釋曲線并計(jì)算α多樣性指數(shù)。結(jié)合各樣品的OTU種類(lèi)及其豐度進(jìn)行計(jì)算，獲得樣品間Unweighted unifrac距離矩陣，利用加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪制PCoA聚類(lèi)圖[18]；根據(jù)門(mén)和屬水平上物種的結(jié)構(gòu)和組成，用OriginPro 9.0 和 R x64 3.0.2軟件繪制門(mén)水平優(yōu)勢(shì)菌屬柱狀圖和共享屬聚類(lèi)熱圖?；?6S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果，用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities byReconstruction of Unobserved States)，通過(guò)比對(duì)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)瘤胃微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并挑選參與主要功能通路的基因，對(duì)其相對(duì)豐度進(jìn)行組間差異性分析[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)LP組和HP組之間磷的真消化率、細(xì)菌相對(duì)豐度等數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，將P<0.05視為差異顯著，P<0.01視為差異極顯著。對(duì)于組間差異顯著的微生物，用其相對(duì)豐度與宿主對(duì)飼料磷的真消化率進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 磷真消化率不同山羊的瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血液生化指標(biāo)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率比較

本試驗(yàn)測(cè)定的28只山羊?qū)θ占Z磷真消化率的平均值為(78.61±7.65)%，變異系數(shù)(CV)為9.73%。用“1.2”中所描述的分組方法，HP和LP組從群體中各挑選出了6只山羊，兩組飼料磷的真消化率分別為(89.20±0.01)%和(68.95±0.05)%，組間差異極顯著(P<0.01)。山羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)見(jiàn)表2，瘤胃pH和揮發(fā)性脂肪酸濃度在HP與LP組間差異均不顯著(P>0.05)。由表3可知，HP組山羊血液磷含量顯著高于LP組(P<0.05)，而血液鈣和堿性磷酸酶含量組間差異不顯著(P>0.05)。從表4可知，HP和LP組山羊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(干物質(zhì)、粗脂肪、粗蛋白、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維)組間差異均不顯著(P>0.05)。

表2HP和LP組山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)比較

Table2ComparisonofrumenfermentationparametersbetweenHPandLPgroupsingoats

項(xiàng)目 ItemHP (n=6)LP (n=6)P值 P value瘤胃pH Rumen pH6.39±0.176.36±0.240.853乙酸/(mmol·L-1) Acetate 31.55±5.0230.18±3.010.579丙酸/(mmol·L-1) Propionate10.77±1.269.59±1.560.184丁酸/(mmol·L-1) Butyrate7.41±1.848.89±1.060.121乙酸/丙酸 Acetate/Propionate2.93±0.203.18±0.430.212

表3HP和LP組山羊血液生化指標(biāo)比較

Table3ComparisonofbloodbiochemicalindexesbetweenHPandLPgroupsingoats

項(xiàng)目 ItemHP (n=6)LP (n=6)P值P value鈣/(mmol·L-1) Ca2.17±0.222.13±0.120.647磷/(mmol·L-1) P2.27±0.232.01±0.220.034堿性磷酸酶/(U·L-1) Alkaline phosphatase160.75±26.85162.12±27.190.920

表4 HP和LP組山羊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率比較

2.2 山羊瘤胃微生物16S rRNA基因的高通量測(cè)序樣品序列和OTU 統(tǒng)計(jì)

本次測(cè)序共獲得915 084條有效序列，平均每個(gè)樣品含有(76 257±4 976)條序列。基于相似度大于97%的原則，將獲得的有效序列進(jìn)行聚類(lèi)，共獲得5 777個(gè)OTU，不考慮處理效應(yīng)，平均每個(gè)樣品含(2 343±129)個(gè)OTU。其中HP組有3 608個(gè)OTU，LP組4 037個(gè)，兩組間共享的OTU有1 868個(gè)(圖1)。

圖1 OTU維恩圖Fig.1 OTU venn diagram

樣品稀釋曲線如圖2所示，在本次試驗(yàn)的測(cè)序深度下，各條曲線最終均趨于平緩，說(shuō)明本次試驗(yàn)的測(cè)序量足以覆蓋各樣品中的絕大多數(shù)微生物。在相同測(cè)序深度下，OTU數(shù)由高到低的HP內(nèi)樣品依次為HP3、HP5、HP2、HP6、HP4和HP1，而LP組內(nèi)各樣品OTU數(shù)由高到低的分別為L(zhǎng)P5、LP1、LP3、LP4、LP6和LP2。

2.3 山羊瘤胃微生物的Alpha多樣性分析

Alpha 多樣性指數(shù)主要用于評(píng)價(jià)樣品中微生物的豐富性和均勻性。表5列出了山羊HP組和LP組樣品的PD_whole_tree指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)。由表5可以看出，在同一測(cè)序深度下(15 230條序列)，LP組的Alpha多樣性指數(shù)在數(shù)值上均大于HP組，其中LP組Shannon指數(shù)顯著大于HP組(P<0.05)。

2.4 山羊瘤胃微生物的Beta 多樣性分析

根據(jù)樣本的OTU種類(lèi)及其相對(duì)豐度，通過(guò)計(jì)算各個(gè)樣本間加權(quán)遺傳距離矩陣?yán)L制PCoA聚類(lèi)圖。由圖3可知， LP組樣品依據(jù)其組別聚集在一起，表明 LP組內(nèi)相似性比組間相似性高；HP組樣品并沒(méi)有依據(jù)其組別而表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集，說(shuō)明LP組組內(nèi)個(gè)體間微生物結(jié)構(gòu)與組成的相似度高于HP組。

2.5 山羊瘤胃微生物的門(mén)水平和屬水平的微生物組成

將試驗(yàn)所得的有效序列在不同分類(lèi)水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，本次試驗(yàn)在門(mén)水平上共注釋得到24種菌。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在兩組中均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其在HP組和LP組中的相對(duì)豐度依次分別為(65.99±6.25)%和(26.97±4.69)%、(59.62±5.92)%和(32.57±5.81)%。兩個(gè)處理組中，相對(duì)豐度大于0.1%的菌門(mén)共有10個(gè)，它們?cè)诮M間的差異性均不顯著(P>0.05)，其在門(mén)水平上的菌群組成見(jiàn)圖4。

圖2 各樣品的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of each sample

表5組間α多樣性指數(shù)的差異性比較

Table5Comparisonofalphadiversityindicesbetweenthetwogroups

α多樣性指數(shù) Alpha diversity indexHP (n=6)LP (n=6)P 值 P valueShannon7.47±0.338.03±0.320.014Chao11 693.98±118.811 725.31±152.670.070PD_whole_tree88.17±5.0093.01±5.110.128

圖3 PCoA聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis by Principal Co-ordinate Analysis

屬水平上，兩組共注釋得到187種菌，基于菌屬種類(lèi)多且部分菌屬的相對(duì)豐度較低，本次僅對(duì)相對(duì)豐度大于0.1%的30個(gè)菌屬進(jìn)行了組間差異分析。結(jié)果表明，共有10個(gè)菌屬的相對(duì)豐度在組間存在顯著性(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異，詳見(jiàn)表6。其中，HP組的Ruminococcaceae_UCG-010、Ruminococcus_2、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Saccharofermentans、Ruminococcaceae_UCG-014、Butyrivibrio和Clostridium等7個(gè)屬的相對(duì)豐度顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于LP組，Prevotella、Desulfovibrio和Selenomonas等3個(gè)屬顯著高于LP組(P<0.05)。

通過(guò)對(duì)磷的真消化率與組間差異菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷的真消化率與Ruminococcaceae_UCG-010(r=-0.621,P<0.05)、Ruminococcus_2(r=-0.746,P<0.01)、Ruminococcaceae_UCG-014(r=-0.865,P<0.01)、Butyrivibrio(r=-0.654,P<0.05)和Clostridium(r=-0.714,P<0.01)的相對(duì)豐度顯著負(fù)相關(guān)；與Prevotella(r=0.862,P<0.01)和Selenomonas(r=0.824,P<0.05)的相對(duì)豐度顯著正相關(guān)(表6)。

表6組間差異顯著的微生物相對(duì)豐度與磷真消化率的相關(guān)性分析

Table6ThecorrelationbetweenphosphorustruedigestibilityandtherelativeabundanceofmicroorganismwithsignificantdifferencebetweenHPandLPgroupsatgeneralevel

分類(lèi)單元 Taxa相對(duì)豐度/% Relative abundanceHP (n=6)LP (n=6)P值 P value相關(guān)系數(shù) r1Correlation coefficient瘤胃球菌科Ruminococcaceae_UCG-0100.459±0.1400.702±0.1860.029-0.621?瘤胃球菌屬Ruminococcus_20.245±0.1410.609±0.2260.008 -0.746??瘤胃球菌科Ruminococcaceae_NK4A214_group1.392±0.3302.070±0.5550.028-0.507產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬Saccharofermentans0.652±0.2961.064±0.2040.019-0.551瘤胃球菌科Ruminococcaceae_UCG-0140.568±0.0320.901±0.2020.003-0.865??普雷沃氏菌屬Prevotella18.945±0.75316.978±0.5710.001 0.862??丁酸弧菌屬Butyrivibrio1.683±0.0691.882±0.1010.003-0.654?脫硫弧菌Desulfovibrio0.191±0.0130.173±0.0100.023-0.588梭菌屬Clostridium0.462±0.0220.547±0.0380.001-0.714??反芻獸月形單胞菌屬Selenomonas0.398±0.1060.225±0.1050.0180.824?

1.此列為微生物相對(duì)豐度與磷真消化率之間的相關(guān)系數(shù)。在此列數(shù)據(jù)中，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)；*表示顯著相關(guān)(P<0.05)

1.This is the correlation coefficient between the relative abundance of microorganisms and the true digestibility of phosphorus. In this row,**means extremely significant correlation (P<0.01),*means significant correlation(P<0.05)

2. 6 飼料磷真消化率不同山羊瘤胃微生物共享屬分析

HP組和LP組組間共有90個(gè)共享屬，相對(duì)豐度大于0.5%的共享屬有23個(gè)，其共享屬聚類(lèi)圖見(jiàn)圖5。由圖5可看出，除HP2、HP4、LP2和LP6外，其它各個(gè)樣品依據(jù)所處組別的不同而相互聚類(lèi)到一起，表明組內(nèi)共享菌群相似性比組間相似度高。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，HP組中HP1和HP2、HP3和HP6分別聚為一簇，LP組中LP1和LP5、LP3和LP4分別聚為一簇，它們的菌群相似度相對(duì)高于同組內(nèi)其它樣品。

圖4 山羊瘤胃微生物在門(mén)水平上的菌群組成Fig.4 Composition of microbial at phylum level of rumen microorganism in goats

橫坐標(biāo)為組名，縱坐標(biāo)為微生物的相對(duì)豐度。越偏藍(lán)色表示相對(duì)豐度越高，越偏綠色表示相對(duì)豐度越低The abscissa is the group name and the ordinate is the relative abundance of the microorganism. The closer to blue, the higher relative abundance, while the closer to green, the lower relative abundance圖5 HP和LP組山羊瘤胃共享菌群在屬水平上的聚類(lèi)熱圖Fig.5 Log-scaled percentage heatmap of shared flora at the shared-genus level between HP and LP groups in goats

2.7 山羊瘤胃微生物的PICRUSt基因預(yù)測(cè)

基于本次試驗(yàn)16S rRNA擴(kuò)增子的測(cè)序結(jié)果，用PICRUSt對(duì)山羊瘤胃微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，圖6展示了相對(duì)豐度大于1%的功能基因，這些基因的豐度之和分別占HP組和LP組總基因豐度的97.18%和97.24%。相對(duì)豐度從高到低的基因功能依次為氨基酸代謝、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、能量代謝等，這些基因的相對(duì)豐度在組間的差異均不顯著(P>0.05)。

橫坐標(biāo)為組名，縱坐標(biāo)為功能基因的相對(duì)豐度。越偏藍(lán)色表示相對(duì)豐度越高，越偏紅色表示相對(duì)豐度越低The abscissa is the group name and the ordinate is the relative abundance of the functional genes. The closer to blue, the higher relative abundance, while the closer to red, the lower relative abundance圖6 功能基因聚類(lèi)熱圖Fig.6 Log-scaled percentage heatmap of the functional genes

3 討 論

由于反芻動(dòng)物唾液和消化道內(nèi)源磷的存在，以往采用表觀消化率這個(gè)指標(biāo)嚴(yán)重低估了動(dòng)物對(duì)飼料磷的真實(shí)消化吸收情況[20]。與磷的表觀消化率相比，真消化率更能真實(shí)且準(zhǔn)確地反映出動(dòng)物機(jī)體對(duì)磷的消化吸收效率[21]。因此，本研究采用差量法測(cè)定了山羊?qū)︼暳狭椎恼嫦?。本試?yàn)中，兩期日糧磷的水平分別為2.2和3.3 g·kg-1DM，磷的供給量低于中國(guó)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中磷的推薦量(3.5 g·kg-1DM)；兩期試驗(yàn)日糧的原料組成及養(yǎng)分含量也基本相同。因此，本試驗(yàn)滿足采用差量法測(cè)定飼料磷真消化率的條件。本研究中，山羊?qū)︼暳狭椎恼嫦势骄禐?8.61%，高于以往單胃動(dòng)物豬[22]和雞[23]的測(cè)定結(jié)果，最主要的原因是由于反芻動(dòng)物瘤胃微生物能夠分泌植酸酶，將飼料中與植酸結(jié)合的磷釋放出來(lái)，從而有利于反芻動(dòng)物對(duì)飼料磷的消化吸收[24]。

研究表明，動(dòng)物對(duì)飼料磷的消化利用效率主要受飼料磷的來(lái)源、磷的水平、鈣磷比和飼糧植酸的水平等因素的影響[25-26]。但本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂相同飼糧，且遺傳背景相同的山羊，飼料磷的真消化率也存在顯著的個(gè)體差異，這在以往的研究中還未見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道。但前人研究發(fā)現(xiàn)，給遺傳背景一致的肉牛飼喂同一飼糧，其消化利用效率存在顯著的個(gè)體差異[27]。因此，磷作為飼糧中一種必不可少的組分，其真消化率存在顯著的個(gè)體差異也應(yīng)該是一種正?，F(xiàn)象。

Azeem等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在豬日糧中加入植酸酶，豬對(duì)菜籽粕和豆粕中磷的消化率均提高約30%。Kincaid等[29]在奶牛日糧中添加植酸酶，奶牛血液中的磷含量顯著增加。Knowlton等[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加植酸酶能顯著提高奶牛磷的消化率，減少糞便中磷的含量。在本研究中，HP組山羊血液磷含量顯著高于LP組，這可能是由兩組山羊瘤胃中微生物結(jié)構(gòu)與組成的差異造成的，因?yàn)榉雌c動(dòng)物瘤胃微生物自身能夠分泌大量的植酸酶催化植酸的水解，釋放日糧中以植酸磷形式存在的磷，提高宿主對(duì)日糧植物磷的消化率，減少動(dòng)物糞便中磷的含量[31-34]。但由于研究技術(shù)的限制，到目前為止，已鑒定出的產(chǎn)植酸酶的瘤胃微生物種類(lèi)很有限，主要有雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)[35]、希瓦氏菌屬(Shewanellasp.)[36]、左旋乳酸芽孢桿菌(Bacilluslaevolacticus)[37]。此外，Yanke等[31]還發(fā)現(xiàn)，反芻獸新月形單胞菌屬(Selenomonassp.)、密螺旋體屬(Treponemasp.)、普雷沃氏菌屬(Prevotellasp.)也能夠分泌植酸酶。其中，反芻獸新月形單胞菌屬中96%的菌株都具有植酸酶分泌活性，植酸酶活性高且變異較大。本研究中，HP組Prevotella和Selenomonas的相對(duì)豐度顯著高于LP組，且兩者的相對(duì)豐度均與磷真消化率呈顯著的正相關(guān)，說(shuō)明Prevotella和Selenomonas可能是尚未被人們認(rèn)識(shí)的能分泌植酸酶的細(xì)菌。

本研究中，組間差異顯著的菌屬中HP組Prevotella和Selenomonas的相對(duì)豐度顯著高于LP組(P<0.05)，并且與磷的真消化率呈顯著正相關(guān)。而其余8個(gè)差異菌屬中，除溶纖維丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)，其它7個(gè)菌屬的相對(duì)豐度均是LP組較高，并且與磷的真消化率呈負(fù)相關(guān)。令人驚奇的是，與磷真消化率呈正相關(guān)的菌屬(Prevotella和Selenomonas)均是瘤胃中最主要的淀粉降解菌；而與磷真消化率呈負(fù)相關(guān)的菌屬，它們主要為纖維降解菌，如瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、溶纖維丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)和和梭菌屬(Clostridium)等。以往的研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物分泌的植酸酶活性隨日糧中粗飼料比例的增加(精料比例的降低)而降低[38]。這可能是由于日糧中粗飼料含量較高時(shí)，瘤胃環(huán)境更有利于纖維降解菌的生長(zhǎng)和繁殖，纖維降解菌的相對(duì)比例會(huì)升高。而瘤胃微生物區(qū)系作為一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，微生物之間存在著競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，纖維降解菌相對(duì)比例的升高一定程度上會(huì)引起其他菌群的比例降低，如淀粉降解菌Prevotella和Selenomonas，最終導(dǎo)致植酸酶的分泌量減少、活性降低。由此可見(jiàn)，瘤胃中纖維降解菌的相對(duì)豐度較高可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制分泌植酸酶的微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而會(huì)減少植酸酶的產(chǎn)量，降低宿主對(duì)磷的消化利用效率。本研究未檢測(cè)瘤胃中微生物植酸酶的活性以及含量。因此，目前尚不能確定瘤胃微生物是否是通過(guò)調(diào)控微生物植酸酶的分泌量或活性來(lái)促進(jìn)磷的消化。但是，本研究發(fā)現(xiàn)了瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與組成與山羊磷真消化率的關(guān)聯(lián)性，這為今后研究調(diào)控微生物以促進(jìn)磷的消化利用提供了嶄新的思路。

本研究中，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes) 在瘤胃微生物中均為優(yōu)勢(shì)菌，這與以往研究結(jié)果一致[39-40]。但是，以往在牛上的研究發(fā)現(xiàn)， Firmicutes在瘤胃微生物中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位[41-42]。出現(xiàn)這種差異的原因可能是，瘤胃微生物的最優(yōu)菌門(mén)可能與反芻動(dòng)物日糧中精料和粗料的比例有關(guān)。因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，日糧是影響瘤胃微生物結(jié)構(gòu)與組成的最主要因素，隨日糧中粗飼料的比例升高，瘤胃中厚壁菌門(mén)的比例會(huì)隨之升高[43]。

4 結(jié) 論

不同飼料磷真消化率的山羊瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)存在著顯著差異，部分瘤胃微生物的相對(duì)豐度與山羊?qū)︼暳狭椎恼嫦手g存在顯著的相關(guān)性；山羊?qū)︼暳狭椎南试礁?，瘤胃中Prevotella和Selenomonas的相對(duì)豐度越高，Ruminococcaceae_UCG-010、Ruminococcus_2、Ruminococcaceae_UCG-014、Butyrivibrio和Clostridium的相對(duì)豐度越低。