李 鳳，崔立欣，郝海生，劉 巖，趙學(xué)明，龐云渭，朱化彬，杜衛(wèi)華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎在體外發(fā)育過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，一定濃度的ROS對(duì)維持細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要[1]。有研究證明,將成熟末期的卵母細(xì)胞短時(shí)間暴露于過(guò)氧化氫中會(huì)改善胚胎的后續(xù)發(fā)育能力[2],但過(guò)量的ROS可以導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化以及線粒體損傷[3-5]。因此，維持ROS動(dòng)態(tài)平衡在胚胎發(fā)育中至關(guān)重要。胚胎體外生產(chǎn)過(guò)程中，常在培養(yǎng)液中添加抗氧化劑，如抗壞血酸、褪黑素、谷胱甘肽等優(yōu)化培養(yǎng)體系，從而降低胞內(nèi)ROS，緩解氧化應(yīng)激對(duì)胚胎的傷害，提高胚胎的生產(chǎn)效率和胚胎質(zhì)量[6]。

谷胱甘肽(glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，是體內(nèi)主要的非酶類抗氧化劑，主要以兩種形式存在，即氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)。GSH占谷胱甘肽總量的99%左右[7]，參與細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、DNA和蛋白質(zhì)合成以及氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。GSH促進(jìn)雄原核的形成[9]、提高胚胎致密化[10]，對(duì)早期胚胎發(fā)育到囊胚階段起關(guān)鍵作用。研究表明,在牛胚胎培養(yǎng)液中添加GSH，可清除胚胎內(nèi)ROS，提高胚胎的抗氧化能力，從而有效提高囊胚率和囊胚質(zhì)量[11]。

本研究向牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液中添加外源GSH，研究其對(duì)胚胎發(fā)育的影響；采用熒光染色法和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography mass spectrometry，LC/MS)定量分析早期受精卵中GSH的含量，確定LC/MS方法的可靠性；另外，在培養(yǎng)液中添加GSH的同位素標(biāo)記物GSX，利用LC/MS對(duì)受精卵內(nèi)GSX含量變化進(jìn)行跟蹤，為探索外源GSH到胚胎內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供研究方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；公牛精液購(gòu)自山東奧克斯生物技術(shù)有限公司。超聲破碎儀Vibra-CellTM購(gòu)自美國(guó)Sonics公司，液相色譜儀LC-20購(gòu)自日本島津公司，質(zhì)譜儀QTRAP?5500 LC/MS購(gòu)自美國(guó)AB SCIEX公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛體外受精胚胎的制備 體外受精(invitrofertilization，IVF)胚胎的生產(chǎn)流程參照文獻(xiàn)[11]。用35～38 ℃生理鹽水清洗卵巢2～3遍，抽取2～6 mm卵泡中的卵泡液，體式顯微鏡下挑選帶有3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用成熟液(含10% FBS、0.01 IU·mL-1FSH、1 IU·mL-1LH、1 μg·mL-1E2、10 μg·mL-1肝素、40 ng·mL-1IGF、50 ng·mL-1EGF的TCM 199培養(yǎng)液)洗滌后，于成熟液中38.5 ℃、100%濕度條件下培養(yǎng)22～24 h。38 ℃水浴解凍冷凍精液，置于含6 mL洗精液(含4 μg·mL-1BSA、10 mmol·L-1咖啡因的BO液[21])中，1 800 r·min-1離心兩次，每次8 min。用洗精液調(diào)整精子密度為2×106·mL-1，取50 μL精子懸浮液加入50 μL受精滴(含4 mg·mL-1BSA的BO液)中。每個(gè)受精滴中移入15枚MII期COCs，于38.5℃、100%濕度條件下培養(yǎng)。受精后8 h(hour post-insemination, hpi)，脫去卵丘細(xì)胞，移入前期培養(yǎng)液(含6 mg·mL-1BSA、1 mmol·L-1L-谷氨酰胺、2% EAA、1% NEAA的mCR1培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，2 d后移入后期培養(yǎng)液(含10% FBS、6 mg·mL-1BSA、1 mmol·L-1L-谷氨酰胺、2% EAA、1% NEAA的mCR1培養(yǎng)液[21])中培養(yǎng)，之后隔天半量換液，培養(yǎng)7～8 d囊胚。從胚胎移入前期培養(yǎng)液開(kāi)始計(jì)算為0 h，分別于48、120和168 h記錄卵裂的胚胎數(shù)、桑椹胚和囊胚數(shù)，計(jì)算相應(yīng)的發(fā)育率。其中處理組于前期和后期培養(yǎng)液中添加3 mmol·L-1GSH或GSX，對(duì)照組則不添加GSH或GSX。每組100個(gè)胚胎，3個(gè)重復(fù)。

在胚胎內(nèi)ROS、GSH和GSX含量分析中，分別收集受精后8、18、24、32 h受精卵用于檢測(cè)。

1.2.2 牛囊胚細(xì)胞染色 培養(yǎng)7 d的囊胚用0.1% BSA-PBS洗3遍后，2%多聚甲醛固定1 h，洗3遍后，置于20 μmol·L-1Hoechst 33342中室溫孵育10 min，用0.1% BSA-PBS清洗后壓片，熒光顯微鏡下拍照,并統(tǒng)計(jì)囊胚總細(xì)胞數(shù)。為防止熒光淬滅，該過(guò)程需在避光條件下進(jìn)行。每組30個(gè)胚胎，共3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 牛胚胎內(nèi)ROS含量的檢測(cè) 采用2,7-dichlorofluoresccein diacetate(DCFH-DA)熒光染色劑測(cè)定胚胎內(nèi)ROS含量[22]。將8、18、24、32 hpi的受精卵(包括對(duì)照組和處理組)在0.1% BSA-PBS中洗3遍，移入50 μmol·L-1的染色液中，避光，38.5 ℃孵育30 min，清洗3遍后，在熒光顯微鏡(Nikon TE-2000)下觀察并拍照，激發(fā)光波長(zhǎng)為450～490 nm。使用Image J軟件(1.47，National Institutes of Health)計(jì)算熒光密度。每組10個(gè)受精卵，3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 采用熒光染色法檢測(cè)牛胚胎中GSH含量 采用4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin(Cell Tracker Blue CMF2HC，Life Technology)對(duì)8、18、24、32 hpi的受精卵(包括對(duì)照組和處理組)染色，測(cè)定其GSH含量。受精卵用0.1% BSA-PBS清洗3遍后，置于10 μmol·L-1染色液中，38.5 ℃避光孵育15 min后取出，0.1% BSA-PBS清洗3遍后在熒光顯微鏡觀察并拍照，激發(fā)光的波長(zhǎng)為330～380 nm。使用Image J軟件計(jì)算熒光密度。

1.2.5 液質(zhì)聯(lián)用儀(LC/MS)檢測(cè)牛受精卵中GSH和GSX的含量 檢測(cè)所用色譜條件：色譜柱HSS T3 (1.7 μm×100 mm× 2.1 mm)，流動(dòng)相A(水，0.1%甲酸) 和B(乙腈)，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5.0 μL，柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：采用正離子模式，離子源的噴霧電壓(ion spray voltage，IS)5 000 V，霧化溫度(temperature，TEM)400 ℃，氣簾氣壓力(curtain gas，CUR)30 kPa，碰撞氣(collision gas，CAD)Medium，霧化氣(ion source gas1，GS1)55 kPa，輔助氣(ion source gas2，GS2)55 kPa。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取GSH或GSX適量，用甲醇分別配制濃度為1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液；甲醇逐級(jí)稀釋，得到0.125、0.250、0.500、1.250、2.500、5.000 μmol·L-1的系列工作液，上樣量為5 μL，得出與標(biāo)準(zhǔn)液濃度相對(duì)應(yīng)的峰面積值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物GSH或GSX濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸。

樣品前處理：分別收集8、18、24、32 hpi的受精卵(對(duì)照組和處理組)，用500 μL冷甲醇破碎提取1 h，加200 μL水混勻后于4 ℃，13 200 r·min-1離心10 min，取上清檢測(cè)。每組30個(gè)受精卵，共3個(gè)重復(fù)。分別收集處理組受精卵(18、24、32 hpi)的培養(yǎng)液50 μL，加入冷甲醇50 μL，再加50 μL水混勻，4 ℃、13 200 r·min-1離心10 min，取上清檢測(cè)。每組重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)使用Photoshop CS5(Adobe，美國(guó))進(jìn)行，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 外源GSH對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響

本研究共使用588枚牛卵母細(xì)胞，體外受精后的胚胎分別培養(yǎng)于含GSH(處理組)和不含GSH(對(duì)照組)的培養(yǎng)液中，發(fā)育至囊胚(表1)。結(jié)果顯示，GSH處理組和對(duì)照組間胚胎的卵裂率無(wú)顯著差異(P>0.05)，但處理組胚胎的桑椹胚率(58.67%vs. 48.46%)、囊胚率(50.83%vs. 34.88%)以及囊胚總細(xì)胞數(shù)(102.26vs. 76.27)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明體外受精胚胎培養(yǎng)液中添加GSH可提高牛體外受精胚胎的囊胚率和囊胚質(zhì)量。

表1GSH對(duì)牛IVF胚胎體外發(fā)育的影響

Table1EffectsofGSHonthedevelopmentofbovineIVFembryos

組別Group卵母細(xì)胞數(shù)No. of oocytes卵裂率/%Cleavage rate桑椹胚率/%Morula rate囊胚率/%Blastocyst rate囊胚總細(xì)胞數(shù)Total cell number of blastocysts對(duì)照組Control29886.57±1.0348.46±2.48b34.88±2.48b76.27±2.27b處理組Treatment29089.69±1.7758.67±3.82a50.83±2.01a102.26±4.89a

同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示組間差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

Different letters in the same column mean significant difference between groups(P<0.05), same letter in the same column means no significant difference between groups (P>0.05)

2.2 外源GSH對(duì)牛受精卵胚胎內(nèi)ROS含量的影響

采用DCFH-DA染色法檢測(cè)210枚受精卵中ROS的含量(圖1)。處理組18、24和32 hpi受精卵中ROS含量均極顯著或顯著低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組中受精卵的ROS含量呈先上升后下降，在18 hpi時(shí)達(dá)最高；處理組受精卵的ROS含量則逐漸降低。可見(jiàn)在培養(yǎng)液中添加GSH可以清除受精卵中ROS。

處理組和對(duì)照組之間所標(biāo)大寫字母相異表示差異極顯著(P<0.01)，所標(biāo)小寫字母相異表示差異顯著(P <0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01), different small letters mean significant difference (P<0.05), same letter means no significant difference between the treatment group and the control group (P>0.05).The same as below圖1 GSH處理對(duì)不同發(fā)育階段的牛受精卵中ROS含量的影響Fig.1 Effects of GSH on the intracellular ROS contents in bovine zygotes at different stages

2.3 LC/MS法測(cè)定牛受精卵中GSH或GSX的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)LC/MS法分別檢測(cè)梯度稀釋的GSH或GSX標(biāo)準(zhǔn)液，獲得GSH的線性回歸方程y=6.67e+5x(e表示10的科學(xué)計(jì)數(shù)、x表示GSH濃度、y表示峰面積)，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2A)；GSX的線性回歸方程為y=1.14e+6x(e表示10的科學(xué)計(jì)數(shù)、x表示GSX濃度、y表示峰面積)，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2B。GSH在0.125～5.000 μmol·L-1線性關(guān)系良好，保留時(shí)間為2.04 min；GSX在0.125～5.000 μmol·L-1線性關(guān)系良好，保留時(shí)間為2.05 min(圖2C)。

圖2 LC/MS法測(cè)定GSH(A)和GSX(B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及圖譜(C)Fig.2 Standard curves of GSH(A)and GSX(B) by LC/MS and their chromatograms (C)

2.4 外源GSH對(duì)牛受精卵內(nèi)GSH含量的影響

210枚受精卵培養(yǎng)于含外源GSH的培養(yǎng)液中，采用熒光染色法對(duì)受精卵中GSH的含量進(jìn)行檢測(cè)(圖3A)。在18、24和32 hpi 3個(gè)發(fā)育階段，處理組受精卵的GSH含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明，培養(yǎng)液中添加GSH可以提高受精卵內(nèi)GSH的含量。

通過(guò)LC/MS法檢測(cè)相同處理的630枚受精卵的GSH含量，結(jié)果表明，3個(gè)發(fā)育階段的處理組受精卵的GSH含量均顯著高于對(duì)照組(圖3B)(P<0.05)。另外，各組中受精卵的GSH含量隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，對(duì)照組中18 hpi受精卵中GSH含量從8.37 pmol降到32 hpi的4.84 pmol，而處理組受精卵中GSH含量則從9.93 pmol降低到6.63 pmol。比較GSH含量的兩種測(cè)定方法，結(jié)果一致。

圖3 熒光染色法和液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)不同發(fā)育階段牛受精卵的GSH含量Fig.3 Intracellular GSH levels in bovine zygotes at different stages by fluorescence staining and LC/MS

2.5 外源GSX對(duì)牛受精卵內(nèi)GSH、GSX及培養(yǎng)液中GSX含量的影響

經(jīng)過(guò)外源GSX處理的受精卵，采用LC/MS方法對(duì)其GSX和GSH含量進(jìn)行檢測(cè)(圖4)，處理組受精卵中GSH含量隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；但均顯著高于各階段(18、24、32 hpi)的對(duì)照組受精卵(P<0.05，圖4A)。處理組的受精卵中均檢測(cè)到GSX的存在，受精卵GSX含量維持在0.9～1.3 pmol(圖4B)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中GSX的濃度呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05，圖5)?？梢?jiàn)培養(yǎng)液添加GSX后，受精卵內(nèi)GSX含量較低，但內(nèi)源GSH的含量顯著升高；同時(shí)培養(yǎng)液中GSX濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)大幅下降。

A.GSH；B.GSX圖4 外源GSX對(duì)不同發(fā)育階段牛受精卵內(nèi)GSH和GSX含量的影響Fig.4 Effect of exogenous GSX on intracellular GSH and GSX levels in bovine zygotes at different stages

圖5 牛受精卵培養(yǎng)液中外源GSX的濃度變化Fig.5 Concentration of exogenous GSX in culture media of bovine zygotes at different stages

3 討 論

GSH是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎中主要的非酶類抗活性氧防御系統(tǒng)之一。眾多的抗氧化物質(zhì)如維生素C、褪黑素、半胱胺、巰基乙醇和N-乙酰-L-半胱氨酸中，關(guān)于GSH的抗氧化作用研究較多[23]，且褪黑素、維生素C和小分子硫醇類抗氧化劑均能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中GSH的合成，提高胚胎內(nèi)GSH含量，從而發(fā)揮其抗氧化的功能[24-26]。研究證明，豬和水牛卵母細(xì)胞的成熟液中添加GSH，可提高體外成熟率，減少胚胎發(fā)育中的個(gè)體差異[27-28]。此外，內(nèi)源GSH可減輕過(guò)氧化氫對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育的阻滯作用，提高小鼠孤雌胚胎的囊胚率和孵化率，顯著降低線粒體空泡及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[29]。卵母細(xì)胞中高濃度的GSH對(duì)合子中雄原核的形成和植入前胚胎的發(fā)育也具有重要作用[30]。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，包裹其外周的卵丘細(xì)胞在GSH合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用；而在體外受精胚胎的培養(yǎng)過(guò)程中，脫去卵丘的受精卵自身無(wú)法合成GSH，因而植入前早期胚胎中的GSH含量顯著降低[31]。本研究在牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液中添加3 mmol·L-1GSH或GSX(同位素標(biāo)記的GSH)以補(bǔ)償胚胎中GSH的消耗，結(jié)果胚胎的囊胚率和囊胚質(zhì)量顯著提高，與本課題組前期的研究結(jié)果一致[11]。

早期胚胎在發(fā)育過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷特定的ROS釋放過(guò)程，并維持動(dòng)態(tài)平衡[32]。在卵母細(xì)胞受精和胚胎第一次卵裂時(shí)ROS的含量增加，耗氧量呈先上升后下降趨勢(shì)；在7～11 hpi ROS到達(dá)峰值，22～25 hpi出現(xiàn)較小幅度的波動(dòng)[33]。在本研究中，18 hpi時(shí)雌雄原核形成產(chǎn)生大量ROS，受精卵處于第一個(gè)細(xì)胞周期的S期，胚胎細(xì)胞進(jìn)行DNA的合成，ROS水平顯著升高，與小鼠3T3細(xì)胞的觀察結(jié)果一致[34]。隨后ROS含量呈下降趨勢(shì)；32 hpi時(shí)胚胎處于2-細(xì)胞期，ROS含量降低。隨著受精的完成，胚胎內(nèi)發(fā)生一系列的細(xì)胞分裂過(guò)程，GSH含量也隨著分裂進(jìn)程而逐漸降低，到囊胚階段GSH含量約為卵母細(xì)胞中的1/10[35]。斑馬魚(yú)胚胎在30 hpi內(nèi)，GSH含量呈顯著下降趨勢(shì)[22]。牛受精卵中GSH含量低于8-～16-細(xì)胞胚胎，此時(shí)更易受到氧化應(yīng)激的影響[36]。本研究利用熒光染色法和LC/MS法檢測(cè)了受精后至第1次分裂期的胚胎內(nèi)GSH含量的變化，該過(guò)程中GSH含量也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

完整的GSH并不能被動(dòng)物細(xì)胞直接吸收，而外源GSH在淋巴細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，GSH會(huì)被細(xì)胞膜上的GGT分解成γ-半胱氨酸甘氨酸和γ-谷氨酰胺，通過(guò)γ-谷氨酰循環(huán)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，然后重新合成GSH并發(fā)揮作用[48]。也有研究發(fā)現(xiàn)在小腸刷狀緣膜囊泡中，完整的GSH可以通過(guò)雙側(cè)膜和基底膜進(jìn)入腸細(xì)胞，不需要GGT參與[49]。然而，外源GSH進(jìn)入胚胎的途徑仍不清楚，因此，筆者利用GSH同位素標(biāo)記物GSX處理胚胎，通過(guò)LC/MS技術(shù)跟蹤胚胎內(nèi)、外GSX的變化，發(fā)現(xiàn)添加GSX的處理組胚胎中GSH含量大幅增長(zhǎng)，而GSX含量卻在0.9～1.3 pmol，相當(dāng)于GSH含量的1/5，可見(jiàn)完整GSH直接進(jìn)入胚胎內(nèi)的可能性較小，可能是通過(guò)γ-谷氨酰循環(huán)途徑進(jìn)入胚胎，這仍需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)在牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中添加GSH，降低了胚胎內(nèi)ROS含量，提高了胚胎的體外發(fā)育率和胚胎質(zhì)量；采用熒光染色法和LC/MS方法檢測(cè)受精卵中GSH含量，證明了LC/MS檢測(cè)GSH方法的可行性、特異性和準(zhǔn)確性；另外，用LC/MS方法追蹤了GSH的同位素標(biāo)記物GSX在不同發(fā)育階段受精卵中的變化，為后期探索外源GSH到胚胎內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提供研究思路。