蘇 偉，母 雨，齊 琦，母應(yīng)春，禹曉婷

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)水平和文化水平的提高，人們對于自身的健康問題越來越重視，健康飲食已然成為熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，黑糯米中含有人體所需的多種營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，具有補(bǔ)血、暖胃、補(bǔ)虛、健脾、促進(jìn)人體微循環(huán)等多種生理功能[3]。保健酒是指在釀造過程中加入了中藥材或其他的營養(yǎng)成分[4]，對人體具有保健功能，但不以治療為目的的飲料酒，其必須具備三個(gè)屬性，即食品屬性、功能屬性、非藥品屬性[5]。黑糯米保健酒是以黑糯米為原料，加入藥食同源的物質(zhì)為輔料，經(jīng)過一系列加工工藝制作而成的營養(yǎng)豐富的飲品。

黑糯米相關(guān)產(chǎn)品已有悠久的歷史，但關(guān)于黑糯米的研究起步較晚。長久以來，黑糯米被添加到各種食品中，但都作為輔料，使得其產(chǎn)品附加值較低。目前對黑糯米的開發(fā)利用主要集中在黑糯米酒、黑糯米醋、黑糯米粑及黑糯米酥等具有地方特色的食品。而對于黑糯米酒的研究又集中于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收方面，尚未對黑糯米酒的功能成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。

本實(shí)驗(yàn)采用AB-INOWAX色譜柱經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)與超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（ultra high performance liquid chromatography-Q exactive-orbitramass spectrometry，UPLC-QE-MS）測定黑糯米酒與黑糯米保健酒中的風(fēng)味成分及化學(xué)成分，進(jìn)行對比分析，找到黑糯米保健酒的特有成分，為黑糯米保健酒保健作用研究提供理論與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米：市售；糖化酶（酶活力10萬U/g）：北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司；增香酵母：四川瀘州市釀酒科學(xué)研究所；Z-20根霉曲：貴州輕工釀酒研究所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：成都曼思特生物科技有限公司；氯化鋁（分析純）：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

HP6890/5957C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1290 UHPLC超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Q Exactive Orbitra高分辨質(zhì)譜：美國ThermoFisherScientific公司；PS-60AL超聲儀：深圳市雷德邦電子有限公司；KQ-300DE酶標(biāo)儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

黑糯米酒的制備參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行；黑糯米保健酒的制備參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.3.2 黑糯米酒與黑糯米保健酒風(fēng)味成分檢測

采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測黑糯米酒與黑糯米保健酒風(fēng)味成分。

樣品前處理：用微量注射器量取1 μL樣品溶液直接進(jìn)樣。

氣相色譜條件：

色譜柱：AB-INOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 mm）毛細(xì)管柱；柱溫：40℃，保留2min；升溫程序：5℃/min升至240℃，保持10 min，運(yùn)行52 min；溶劑延遲時(shí)間：1 min；汽化室溫度：250℃；載氣：高純氦氣（He）；流量：1 mL/min；柱前壓：7.64psi；分流比：20∶1。

質(zhì)譜條件：

離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 529 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～500 amu。

定性定量分析：用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)對總離子流圖中的各個(gè)出峰進(jìn)行檢索，核對美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫，確定化學(xué)成分。采用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對含量。

1.3.3 黑糯米酒與黑糯米保健酒化學(xué)成分檢測

黑糯米酒與黑糯米保健酒化學(xué)成分檢測采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜法。

樣品前處理：移取100 μL酒液至EP管中，加入300 μL甲醇（含內(nèi)標(biāo)），渦旋混勻30 s；超聲10 min（冰水?。┖笥?20℃靜置1h；將酒液在4℃、12000r/min條件下離心15min；取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測。

超高效液相色譜條件：

色譜柱：UPLCHSST3色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；進(jìn)樣體積為1μL，洗脫程序見表1。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

流動(dòng)相組成：

正離子模式：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B為乙腈。

負(fù)離子模式：流動(dòng)相A為5mmol/L乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B為乙腈。

質(zhì)譜條件：

Thermo Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Xcalibur，版本：4.0.27）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：20 eV、40 eV、60 eV，掃描速率：7 Hz。高分辨質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Parameters of mass spectrometry

定性定量分析：使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzML格式。再使用XCMS做保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。使用OSI-SMMS（version 1.0，大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司）軟件配合自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)鑒定。采用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種黑糯米酒中風(fēng)味化合物的GC-MS分析結(jié)果

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對黑糯米酒和黑糯米保健酒的風(fēng)味成分進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見圖1，各風(fēng)味成分定性和定量分析結(jié)果見表3，兩種酒風(fēng)味成分的種類及數(shù)量見圖2。

圖1 黑糯米酒（A）及黑糯米保健酒（B）風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of flavor components in black glutinous rice wine(A)and black glutinous rice health wine(B)analyzed by GC-MS

表3 黑糯米酒與黑糯米保健酒中風(fēng)味成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 GC-MS analysis results of flavor components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

續(xù)表

由表3可知，在兩種酒中共檢出53種成分，包含醇類、酮類、酸類、酯類、醛類等，這些成分是構(gòu)成酒香味成分的骨架和基礎(chǔ)，同時(shí)也是考察酒質(zhì)量的主要依據(jù)之一[6]。

黑糯米保健酒中共檢測到45種香氣物質(zhì)，其主體成分為醇類（39.519%）、酮類（19.467%）、醛類（15.075%）和酸類（9.611%）。主要揮發(fā)性物質(zhì)有乙醇（32.318%）、1,3-二羥基丙酮（11.207%）、5-（羥甲基）糠醛（8.42%）、乙酸（6.518%）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-4-酮（5.519%）、羥乙醛（4.302%）、甲酸（2.729%）、2-呋喃甲醇（2.569%）。

黑糯米酒中共檢測到47種香氣成分，其主體風(fēng)味成分為醇類（57.284%）、醛類（13.161%）和酮類（11.36%）。主要揮發(fā)性物質(zhì)包括乙醇（51.519%）、5-（羥甲基）糠醛（10.982%）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-4-酮（5.542%）、1,3-二羥基丙酮（5.001%）、乙酸（2.969%）、丙三醇（2.244%）、2-呋喃甲醇（1.911%）。

圖2 黑糯米酒與黑糯米保健酒香氣成分種類及含量Fig.2 Types and contents of aroma components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由圖2可知，黑糯米保健酒的酸類、醛類、酮類化合物含量高于黑糯米酒，醇類化合物含量低于黑糯米酒。這是由于醇的氧化或脫氫反應(yīng)能生成醛、酮、酸，故黑糯米保健酒在生成更多醛、酮、酸類化合物的同時(shí)，其醇類化合物含量下降。

黑糯米保健酒主體風(fēng)味成分中含量最大的物質(zhì)分別是乙醇、1,3-二羥基丙酮、5-（羥甲基）糠醛和乙酸。其中，乙醇含量直接關(guān)系到酒精濃度，而長期飲用酒精度過高的酒易導(dǎo)致一系列疾病，如酒精性肝病[7]、酒精性心肌病[8]等。二羥基丙酮是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且對人體和環(huán)境無毒害，是一種具有多功能的添加劑，可用于化妝品、醫(yī)藥及食品行業(yè)[9]。5-（羥甲基）糠醛被證明是補(bǔ)肝益腎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[10]。乙酸作為白酒中主要的揮發(fā)性酸和調(diào)味酸，是構(gòu)成白酒香氣的主要物質(zhì)之一[11]。

2.2 兩種黑糯米酒UHPLC-QE-MS結(jié)果分析

采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QE-MS）儀對黑糯米酒和黑糯米保健酒的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，總離子流色譜圖見圖3和圖4。兩種酒的化學(xué)成分類別及相對含量見表4。

圖3 黑糯米保健酒中化學(xué)成分UPLC-QE-MS檢測基峰色譜圖Fig.3 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice health wine analyzed by UPLC-QE-MS

圖4 黑糯米酒中化學(xué)成分UPLC-QE-MS檢測基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice wine analyzed by UPLC-QE-MS

表4 黑糯米酒與黑糯米保健酒中化學(xué)成分UPLC-QE-MS分析結(jié)果Table 4 UPLC-QE-MS analysis results of chemical components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由表4可知，從兩種酒中共檢出534種化學(xué)成分，黑糯米酒含有527種化學(xué)成分，黑糯米保健酒含有529種化學(xué)成分。其中，黑糯米酒有一種特有氨基酸類物質(zhì)，黑糯米保健酒有三種特有物質(zhì)，包括兩種黃酮類和一種酸類物質(zhì)。將所有化學(xué)成分分為低聚肽、氨基酸、黃酮、酚、醇、酸、酮及其他共8大類。除其他類外，兩種酒中含量最多的是氨基酸，其次是酸類和低聚肽；而物質(zhì)種類最多的是低聚肽，其次是氨基酸和酸類。另外，兩種酒中僅黃酮類物質(zhì)變化巨大，峰面積增長倍數(shù)超過30倍，其余幾類物質(zhì)含量變化較小。

兩種酒中存在大量的氨基酸是由于富含蛋白質(zhì)的黑糯米在經(jīng)過浸泡、蒸煮、發(fā)酵后，大部分蛋白質(zhì)水解為氨基酸。氨基酸不僅是合成蛋白的重要原料，而且為生長代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。如苯丙氨酸是參與腎及膀胱功能修復(fù)的主要物質(zhì)[13]；異亮氨酸參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)及代謝，腦下腺屬總司令部，作用于甲狀腺、性腺；賴氨酸不僅是肝、膽的組成成分同時(shí)還能促進(jìn)大腦發(fā)育及脂肪代謝；色氨酸可促進(jìn)胃液及胰液的產(chǎn)生；蛋氨酸（甲硫氨酸）可抑制霉菌，有著解毒的功能。無論哪一種氨基酸對于人體來說都是非常重要的，缺乏任何一種就會(huì)影響人體代謝的運(yùn)行，導(dǎo)致疾病。與氨基酸相比，低聚肽的含量較低是因?yàn)楹谂疵字袃H有小部分蛋白質(zhì)水解為分子質(zhì)量更小的肽類物質(zhì)。由≤10個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子肽稱為低聚肽，也叫做寡肽，其具有較高的保健功能。研究發(fā)現(xiàn)，低聚肽具有增強(qiáng)機(jī)體免疫[14]、緩解疲勞、抗氧化、減輕慢性炎癥等功能[15]。鮑雷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，吉林人參低聚肽可提高小鼠的性功能，顯著增加其性器官臟器指數(shù)。

酸類物質(zhì)在兩種酒中均占其物質(zhì)總量的20%左右，其中含量最大的是L-乳酸，分別占黑糯米酒和黑糯米保健酒中酸類物質(zhì)總量的38.805%和45.441%。酸類物質(zhì)能與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，從而賦予酒體香味。乳酸是一種天然有機(jī)酸，釀造過程中存在適宜濃度的乳酸既能降低pH促進(jìn)糖化，又有利于酵母發(fā)酵，從而提高產(chǎn)品的質(zhì)量和風(fēng)味[17]。

黃酮類化合物有提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化及清除自由基的能力，可對人體腎臟起到一定的保護(hù)作用。在腎臟疾病發(fā)展過程中，氧化損傷是非常重要的一個(gè)因素，例如損傷腎小球基底膜、引起炎性反應(yīng)和血小板聚集等相關(guān)腎臟疾病都與其息息相關(guān)[18]。由于氧化應(yīng)激而引發(fā)的糖尿病腎病[19-20]以及腎小球和腎小管實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎功能的不斷惡化[21]，使得黃酮類化合物用作天然抗氧化劑來防治糖尿病的并發(fā)癥備受關(guān)注[22]。李海山等[23]發(fā)現(xiàn)類黃酮物質(zhì)可降低染鉑大鼠腎損傷，或與其抗氧化活性相關(guān)。研究表明，糖尿病大鼠在經(jīng)酸棗仁黃酮干預(yù)后，其氧化應(yīng)激造成的腎損傷得到減輕，酸棗仁黃酮可抑制腎細(xì)胞凋亡，從而減輕腎損傷時(shí)的結(jié)構(gòu)改變[24]。

結(jié)果表明，黑糯米保健酒的特有成分為雌馬酚、大豆苷元和甘草酸；黑糯米酒的特有成分為黃嘌呤。雌馬酚是大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物，生物活性廣泛，具有抗氧化作用、免疫調(diào)控功能和保健功能。大豆苷元同屬于黃酮類化合物，是異黃酮的一種，研究發(fā)現(xiàn)大豆苷元可以有效的防止骨質(zhì)疏松，防治前列腺癌，并可以降低對酒精的依賴度。甘草酸又稱甘草皂苷，是從天然植物甘草中提取的，是甘草的主要活性成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)甘草酸對缺血再灌注性、梗阻性、高血糖性、藥物性（馬兜鈴酸、慶大霉素、順鉑、阿霉素、鎘等引起的）、變態(tài)反應(yīng)性腎損傷都有保護(hù)作用，臨床研究肯定了甘草酸在治療腎綜合征出血熱中的療效[25]。黃嘌呤是嘌呤降解途徑的產(chǎn)物，并會(huì)在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)換為尿酸。故黑糯米保健酒中高含量的尿酸可能是由于其中的黃嘌呤全部轉(zhuǎn)化為尿酸。

相較于黑糯米酒，黑糯米保健酒中含量較大的成分有羥基香豆素和乙酰膽堿。羥基香豆素具有較強(qiáng)的解痙、鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)也能溫和、持續(xù)地促進(jìn)膽汁分泌，加強(qiáng)膽囊收縮和抑菌作用，具有明顯的利膽作用，還有利于結(jié)石排出，對膽總管結(jié)石有一定排石效果。臨床上主要用于膽囊炎、膽道感染、膽結(jié)石、膽道術(shù)后綜合征。乙酰膽堿是一種神經(jīng)遞質(zhì)，中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，乙酰膽堿是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識(shí)的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。

3 結(jié)論

通過GC-MS檢測到黑糯米保健酒中含有44種揮發(fā)性物質(zhì)，主體風(fēng)味成分為醇類（39.519%）、酮類（19.467%）、醛類（15.075%）和酸類（9.611%）；黑糯米酒中共檢測到47種香氣成分，其主體風(fēng)味成分為醇類（57.284%）、醛類（13.161%）和酮類（11.36%）。黑糯米保健酒的醛、酮、酸類化合物含量高于黑糯米酒，而醇類化合物含量低于黑糯米酒，這是因?yàn)槿?、酮、酸類物質(zhì)來源于醇類物質(zhì)的氧化或脫氫反應(yīng)。

通過UPLC-QE-MS從黑糯米保健酒中共檢出529種化學(xué)成分，主體化學(xué)成分為氨基酸（42.671%）和酸類（20.383%）；從黑糯米酒中檢出527種化學(xué)成分，其主體化學(xué)成分同樣是氨基酸（37.708%）和酸類（18.431%）。與黑糯米酒相比，黑糯米保健酒中黃酮類物質(zhì)含量增加30余倍，其特有成分為雌馬酚、大豆苷元和甘草酸，含量較大的成分有羥基香豆素和乙酰膽堿。