譚麗容,代文豪,羅志鋒,李文治,黎 攀,林微微,程 敏*,杜 冰
(1.無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東 廣州 510623;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州 510642)
巴戟天(Morinda officinalisHow.)來(lái)源于茜草科巴戟屬植物巴戟天的干燥根,主要成分包括多糖及寡糖、蒽醌、水晶蘭苷、有機(jī)酸等化合物及無(wú)機(jī)元素,是我國(guó)著名的四大南藥之一[1],具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、提高細(xì)胞免疫功能等功效[2-3]。炮制作為巴戟天入藥前必須經(jīng)過(guò)的工序,主要有鹽制巴戟天、發(fā)酵法炮制、蒸制巴戟天、甘草水制巴戟天(制巴戟天)、煮制巴戟天,目前巴戟天的炮制研究主要集中在鹽制及甘草水制方面。對(duì)于各類(lèi)炮制品的質(zhì)量和工藝,目前行業(yè)尚未定制統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),這阻礙了炮制品的研發(fā)和生產(chǎn)等[4-5]。
發(fā)酵法炮制中草藥是中藥炮制方法之一,是中草藥通過(guò)微生物發(fā)酵,借助于酶和微生物的作用改變中草藥原有的性質(zhì)藥效等,進(jìn)而增強(qiáng)原有功效或產(chǎn)生新的功效,擴(kuò)大中草藥原有的用藥品種,以適應(yīng)臨床用藥的需要[6]。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)巴戟天發(fā)酵法炮制鮮有文獻(xiàn)報(bào)道,只有一篇論文報(bào)道了巴戟天發(fā)酵炮制的研究,其利用酵母菌發(fā)酵巴戟天提高了巴戟天多糖的含量[7]。因此,本研究在篩選適合巴戟天發(fā)酵炮制菌種的基礎(chǔ)上,研究發(fā)酵炮制過(guò)程中活性成分的變化,旨在為發(fā)酵法炮制巴戟天的研究開(kāi)拓新的領(lǐng)域。
1.1.1 材料
工廠巴戟天(抽芯干燥巴戟天(MorindaofficinalisHow.):廣東省云浮市郁南縣大方鎮(zhèn)巴戟天市場(chǎng)。
1.1.2 菌種
芽孢桿菌屬(Bacillussp.)DU-106、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum):華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心保藏,并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g菌粉,作為實(shí)驗(yàn)室備用;釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)RV171:安琪酵母公司。
1.1.3 試劑
氯仿、甲醇、乙醇(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲基異茜草素、甲基異茜草素-1-甲醚、寡糖、水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>98%):由本研究室分離純化得到。
1.1.4 培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基:10 g葡萄糖,10 g NaCl,1 000 mL蒸餾水,115℃高壓滅菌20 min。
DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;YSC-2數(shù)控超聲波清洗器:昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;VD-650桌上式潔凈式工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;Ultimate3000高效液相色譜(high performance liquid chromatograph,HPLC)儀:美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
1.3.1 鹽制巴戟天
將工廠巴戟天用清水洗凈,去除泥土,瀝干待用。每50 g工廠巴戟天中加入50 mL、2%的NaCl中煮沸60 min,撈出瀝干,于60℃條件下熱風(fēng)干燥24 h,得鹽制巴戟天。
1.3.2 發(fā)酵巴戟天
活化液:分別將0.10 g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106、0.10 g鼠李糖乳桿菌、0.10g植物乳桿菌、0.10g釀酒酵母菌RV171溶于50 mL的2%葡萄糖水中,37℃、160 r/min條件下振蕩混勻活化30 min即為活化液。
發(fā)酵:將瀝干待用的巴戟天用清水于100℃煮制20min,在超凈工作臺(tái)上將150 g煮制后的巴戟天置于350 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,分別取1 mL活化液接種于培養(yǎng)基中,搖勻。30℃條件下發(fā)酵12 d。取出瀝干,60℃條件下烘干24 h,烘干的樣品粉碎后過(guò)2號(hào)篩,于4℃保存,得芽孢桿菌DU-106發(fā)酵巴戟天、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵巴戟天、植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天、釀酒酵母發(fā)酵巴戟天。
1.3.3 活性成分的檢測(cè)
水分含量測(cè)定:采用水分含量測(cè)定儀測(cè)定水分含量,每個(gè)樣品重復(fù)3次[8]。
水溶性浸出物測(cè)定:精確稱(chēng)定樣品4 g,按照2010年版《中國(guó)藥典》中冷浸法對(duì)可溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定[9]。
多糖含量測(cè)定:精密稱(chēng)量巴戟天粉末0.200 g于圓底燒瓶中,加入150 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,80℃條件下水浴加熱2 h,過(guò)濾;濾渣加入150 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇,80℃條件下水浴加熱2 h,過(guò)濾;濾渣加入150 mL水,100℃水浴加熱2h,過(guò)濾,取濾液濃縮,冷卻,定容至100mL。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[10-11]。
游離蒽醌含量測(cè)定:精密稱(chēng)量巴戟天粉末1.0 g置圓底燒瓶中,加入50 mL氯仿,85℃條件下水浴回流1 h后補(bǔ)加20 mL氯仿,繼續(xù)回流1 h,過(guò)濾,將濾液中的氯仿?lián)]干,加入0.5%醋酸鎂-甲醇溶液溶解,采用0.5%醋酸鎂-甲醇法測(cè)定游離蒽醌的含量[12]。
甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量測(cè)定:精密稱(chēng)量巴戟天粉末2.000g,加氯仿100mL,85℃回流提取2次,每次2 h,濾液合并,回收氯仿,殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL容量瓶中,搖勻,以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定濾液中甲基異茜草素-1-甲醚、甲基異茜草素含量[13]。HPLC條件為色譜柱:DiamonsilTMC18(4.6mm×250mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B);梯度洗脫(0~5 min,20%A;5~10 min,20~44%A;10~40 min,44%A;40~50 min,44~95%A;50~55 min,95%A);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):277nm;柱溫:30℃。
寡糖含量測(cè)定:精密稱(chēng)量巴戟天粉末0.5 g于圓底燒瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇50 mL,85℃回流15 min,轉(zhuǎn)移到具塞錐形瓶中,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)20min,冷卻、稱(chēng)質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇補(bǔ)足至50mL,于4 000 r/min條件下離心10 min,上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液。采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定巴戟天寡糖(D-果糖、D(+)-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖)含量[14]。HPLC色譜條件為色譜柱:ZORBAX NH2柱(2500 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:乙腈(A)-超純水(B);梯度洗脫(0~5 min,70%A~85%A;5~15min,85%A~70%A;15~45min,70%A;后運(yùn)行5min);流速:1.2 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector,ELCD)。
水晶蘭苷含量測(cè)定:精密稱(chēng)量巴戟天粉末1.000 g于具塞三角瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇100 mL,15℃條件下冷浸1 h,超聲處理(220 W,55 kHz)1 h,過(guò)濾,殘?jiān)尤塍w積分?jǐn)?shù)80%的甲醇50 mL,再超聲處理30 min,合并提取液,揮干,殘?jiān)蛹状既芙猓⑥D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定水晶蘭苷含量[15]。HPLC色譜條件為色譜柱:Kromalsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.4%磷酸水溶液(90∶10,V∶V);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):233 nm;檢測(cè)時(shí)間:15 min;進(jìn)樣量:5 μL。柱溫:30 ℃。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析
數(shù)據(jù)采用Office Excel 2016及DPS 7.05軟件進(jìn)行處理;作圖采用Office Excel 2016及GraphPad Prism 7。
不同炮制方法對(duì)巴戟天水分含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。
由圖1可知,工廠巴戟天水分含量最低(15.21%);不同菌種發(fā)酵的4種巴戟天水分含量都在19%~21%;鹽制巴戟天的水含量較高(26.38%)。鹽制巴戟天的水分含量顯著高于發(fā)酵炮制和工廠炮制的巴戟天(P<0.05),分析原因可能由于鹽煮炮制使得鹽制巴戟天含鹽量較高,貯存時(shí)易吸水,導(dǎo)致含水量較高。
圖1 不同炮制方法對(duì)巴戟天水分含量的影響Fig.1 Effect of different processing methods on moisture in Morinda officinalisHow.
不同炮制方法對(duì)巴戟天水溶性浸出物含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 不同炮制方法對(duì)巴戟天水溶性浸出物含量的影響Fig.2 Effect of different processing methods on water soluble extracts content inMorinda officinalisHow.
由圖2可知,工廠巴戟天和鹽制巴戟天的水溶性浸出物含量都較高,均達(dá)到了干質(zhì)量的86%以上,且無(wú)顯著性差異(P>0.05);而芽孢桿菌DU-106及乳酸菌發(fā)酵后的巴戟天水溶性浸出物含量在55%~62%,且無(wú)顯著性差異(P>0.05);酵母菌發(fā)酵后的巴戟天水溶性浸出物含量最低,為34.67%。說(shuō)明發(fā)酵會(huì)顯著降低巴戟天中的水溶性物質(zhì)(P<0.05),且酵母消耗最多,而鹽煮炮制巴戟天中可能鹽含量較高,導(dǎo)致水溶性浸出物含量較高。
不同炮制方法對(duì)巴戟天多糖含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 不同炮制方法對(duì)巴戟天多糖含量的影響Fig.3 Effect different processing methods on polysaccharide content inMorinda officinalisHow.
由圖3可知,酵母發(fā)酵巴戟天多糖含量最多,為4.03%,較工廠巴戟天(2.91%)提高了38.38%;其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵巴戟天,多糖含量為3.79%,較工廠巴戟天提高了30.09%;鹽制巴戟天和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天多糖含量無(wú)顯著性差異(P>0.05),較工廠巴戟天分別提高26.00%和25.39%;植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天多糖含量為3.32%,也能顯著提高巴戟天多糖含量(P<0.05),較工廠巴戟天提高了14.10%。由此得出,發(fā)酵炮制和傳統(tǒng)鹽制相較于工廠巴戟天都能顯著性的提高巴戟天多糖含量(P<0.05),說(shuō)明無(wú)論是傳統(tǒng)炮制還是發(fā)酵炮制,都能顯著提高巴戟天多糖含量(P<0.05)。
不同炮制方法對(duì)巴戟天游離蒽醌含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 不同炮制方法對(duì)巴戟天游離蒽醌含量的影響Fig.4 Effect of different processing methods on free anthraquinone content inMorinda officinalisHow.
由圖4可知,相比于未處理的工廠巴戟天(0.024mg/g),除鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天外,其他炮制方法都顯著提高了巴戟天中游離蒽醌的含量(P<0.05)。芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天中游離蒽醌含量最高(0.057 mg/g);其次是酵母菌發(fā)酵后的巴戟天(0.052mg/g),相比于工廠巴戟天分別提高了139.83%、118.71%,且顯著高于傳統(tǒng)鹽制的巴戟天(P<0.05);植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天游離蒽醌含量為0.047 mg/g,與鹽制巴戟天無(wú)顯著性差異(P>0.05),相比于工廠巴戟天提高了96.37%。
甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素為巴戟天中主要蒽醌類(lèi)物質(zhì),不同炮制方法對(duì)巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 不同炮制方法對(duì)巴戟天甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量的影響Fig.5 Effect of different processing methods on rubiadin-1-methylether and rubiadin content inMorinda officinalisHow.
由圖5可知,工廠巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素的含量分別為30.2 mg/kg、9.2 mg/kg;酵母菌發(fā)酵后的巴戟天中的甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素含量都最高,分別為38.9 mg/kg和11.1 mg/kg,與游離蒽醌含量(0.057 mg/g)基本符合,較工廠巴戟天均顯著提高(P<0.05);其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天,甲基異茜草素-1-甲醚的含量為30.7 mg/kg,甲基異茜草素含量為10.9 mg/kg,比游離蒽醌含量(0.057 mg/g)低,分析原因可能是發(fā)酵后,部分甲基異茜草素-1-甲醚或甲基異茜草素轉(zhuǎn)化成了其他蒽醌類(lèi)物質(zhì);鹽制巴戟天、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚含量分別為22.7mg/kg、19.5mg/kg、16.4mg/kg,甲基異茜草素含量分別為6.4 mg/kg、7.1 mg/kg、6.3 mg/kg,均顯著低于工廠巴戟天(P<0.05)。
不同炮制方法對(duì)巴戟天水晶蘭苷含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。
由圖6可以看出,鹽制巴戟天中的水晶蘭苷含量最高(23.0 mg/g);其次是芽孢桿菌DU-106發(fā)酵后的巴戟天(19.9 mg/g);酵母菌發(fā)酵后的巴戟天的水晶蘭苷含量為14.3 mg/g;鼠李糖乳桿菌發(fā)酵巴戟天和植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天的水晶蘭苷含量無(wú)顯著性差異(P>0.05),分別達(dá)到了10.17 mg/g和8.86 mg/g。相比于工廠巴戟天(5.38 mg/g),4個(gè)菌種(芽孢桿菌DU-106、酵母菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌)發(fā)酵后的巴戟天中水晶蘭苷分別提高了269.76%、166.59%、89.01%和64.70%。相比于傳統(tǒng)鹽制巴戟天,4個(gè)菌種發(fā)酵后的巴戟天都沒(méi)有達(dá)到鹽制巴戟天的水晶蘭苷含量。
圖6 不同炮制方法對(duì)巴戟天中水晶蘭苷含量的影響Fig.6 Effect of different processing methods on monotropein content inMorinda officinalisHow.
不同炮制方法對(duì)巴戟天寡糖(D-果糖、D(+)-無(wú)水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖)含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 不同炮制方法對(duì)巴戟天中寡糖含量的影響Fig.7 Effect of different processing methods on oligosaccharide content inMorinda officinalisHow.
由圖7可知,鹽制、芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵巴戟天均能顯著提高巴戟天中果糖含量(P<0.05),果糖含量分別為374.92 mg/g、61.04 mg/g、61.03 mg/g、57.30 mg/g,而酵母菌發(fā)酵后的巴戟天未測(cè)出果糖,分析原因可能是酵母菌消耗了巴戟天中的果糖;相比于鹽制巴戟天,芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中的果糖含量都顯著低于傳統(tǒng)鹽制巴戟天(P<0.05)。以果糖為指標(biāo),芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發(fā)酵炮制巴戟天。
工廠、鹽制、酵母菌發(fā)酵后的巴戟天中均未測(cè)出葡萄糖,芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中葡萄糖含量分別為17.79 mg/g、11.90 mg/g和11.82 mg/g。原因可能是芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵炮制巴戟天轉(zhuǎn)化生成了葡萄糖,而酵母菌消耗了葡萄糖,故未測(cè)出。以葡萄糖為指標(biāo),芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合發(fā)酵炮制巴戟天。
相較于工廠巴戟天(36.16 mg/g),其中3個(gè)菌種芽孢桿菌DU-106(12.68 mg/g)、鼠李糖乳桿菌(28.15 mg/g)、植物乳桿菌(29.02 mg/g)、發(fā)酵巴戟天均不同程度消耗了巴戟天中的蔗糖(64.92%、22.14%、19.74%),而鹽制巴戟天(102.94 mg/g)提高了蔗糖含量(184.69%),其中植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌消耗較少,而芽孢桿菌DU-106消耗較多,酵母菌全部消耗,說(shuō)明酵母菌不太適合發(fā)酵炮制巴戟天。
4個(gè)菌種發(fā)酵炮制巴戟天都消耗了1-蔗果三糖,芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵后的巴戟天中1-蔗果三糖含量分別為9.89 mg/g、16.24 mg/g、13.33 mg/g,而酵母菌發(fā)酵巴戟天中未測(cè)出蔗果三糖。相比于工廠巴戟天,DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵分別消耗了巴戟天63.12%、39.49%、50.32%的1-蔗果三糖,而酵母菌全部消耗了巴戟天中的蔗果三糖。相比于傳統(tǒng)鹽制巴戟天[16],4個(gè)菌種發(fā)酵炮制巴戟天都不能達(dá)到鹽制提高蔗果三糖含量的效果。
耐斯糖為《中國(guó)藥典》中規(guī)定巴戟天質(zhì)量的特征指標(biāo)。經(jīng)炮制后的巴戟天中耐斯糖含量都有所下降?!吨袊?guó)藥典》中規(guī)定耐斯糖含量標(biāo)準(zhǔn)是2%,其中酵母菌發(fā)酵的巴戟天中耐斯糖含量不達(dá)標(biāo)。相比于工廠巴戟天,芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發(fā)酵均顯著降低了巴戟天中的耐斯糖含量(P<0.05),分別消耗了巴戟天55.30%、43.22%、43.40%和91.77%的耐斯糖。相比于鹽制巴戟天,4個(gè)菌種發(fā)酵都不能達(dá)到傳統(tǒng)鹽制消耗巴戟天耐斯糖較少的效果。由此得出,無(wú)論是傳統(tǒng)炮制方法還是發(fā)酵炮制方法,巴戟天中的耐斯糖都被不同程度的消耗。
相比于工廠巴戟天,經(jīng)炮制后的巴戟天中1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都有顯著性下降(P<0.05)。其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌發(fā)酵分別消耗了巴戟天58.83%、52.52%、58.26%、93.36%的1F-果呋喃糖基耐斯糖。相比于鹽制巴戟天,4個(gè)菌株中除酵母菌株外,其他3個(gè)菌株發(fā)酵后的巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖含量都達(dá)到了或高于傳統(tǒng)鹽制巴戟天的水平,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由此得出,無(wú)論是傳統(tǒng)炮制方法還是發(fā)酵炮制方法,都會(huì)不同程度的消耗巴戟天中的1F-果呋喃糖基耐斯糖,其中芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為合適發(fā)酵巴戟天。
通過(guò)對(duì)巴戟天中6種寡糖的測(cè)定,與工廠巴戟天和傳統(tǒng)鹽制巴戟天相比,4個(gè)菌種中,芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌較為適合作為發(fā)酵巴戟天的菌種,而酵母菌不適合發(fā)酵巴戟天。
通過(guò)比較不同炮制法巴戟天中的各活性成分發(fā)現(xiàn),以工廠巴戟天為對(duì)照,傳統(tǒng)腌制法優(yōu)于發(fā)酵法炮制巴戟天;芽孢桿菌DU-106、鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌發(fā)酵法炮制巴戟天均顯著提高了工廠巴戟天中的水分含量、多糖含量、游離蒽醌總量、水晶蘭苷、果糖、葡萄糖含量(P<0.05),而不同程度的消耗了工廠巴戟天中的水溶性浸出物、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖,其中酵母菌幾乎全部消耗了巴戟天中的寡糖,芽孢桿菌DU-106優(yōu)于鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌,更適合發(fā)酵炮制巴戟天。