張麗華，李珍珠，王維靜，劉夢培，王小媛，葛珍珍，縱 偉*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002；3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗室，河南 鄭州 450002）

紅棗是中國特有的經(jīng)濟(jì)果品，占全球紅棗總產(chǎn)量的90%以上。紅棗的可溶性固形物含量高（干棗60%～80%，鮮棗25%～30%），可發(fā)酵糖約是葡萄的3～4倍，是微生物發(fā)酵釀酒及釀醋的優(yōu)良水果資源之一[1-4]。近年來，隨著人們健康意識的加強(qiáng)，發(fā)酵型果蔬低醇飲料以其酒精度低、營養(yǎng)豐富和口感好等特點(diǎn)越來越被消費(fèi)者所接受和喜愛。然而，關(guān)于低醇飲料的概念暫沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。歐盟視酒精含量≤1.0%vol的酒精飲料為低醇飲料；德國則規(guī)定酒精含量＜1.5%vol；在中國，乙醇含量＜0.5%vol的啤酒是無醇啤酒，乙醇含量在0.5%vol～2.5%vol是低醇啤酒[5]。大部分關(guān)于低醇飲料的報道指出[6-8]，酒精含量＜7.0%的果酒或飲料即可定義為低醇產(chǎn)品。這主要是相較于NY/T1508—2017《綠色食品果酒》果酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對果酒酒精度的論述而言的：果酒是以葡萄以外的新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的發(fā)酵酒，酒精度一般在7%vol～18%vol[9]。

棗酒是以紅棗漿（或汁）為原料，接入酵母菌發(fā)酵制成的果酒，兼有酒香和棗香的獨(dú)特風(fēng)味，是紅棗深加工的重要途徑之一。目前，國內(nèi)外對棗酒的研究主要集中在棗酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析[1-2，10-11]、質(zhì)量控制[3，12]、發(fā)酵過程中成分變化[13-15]以及專用酵母菌篩選[16]等方面。然而，關(guān)于果酒釀造過程中殺菌方式的研究并不多見。亞硫酸鹽是目前果酒釀造過程常用的防腐抗氧化劑[17]，廣泛應(yīng)用于葡萄酒和各種果酒的加工中[18]。雖然亞硫酸鹽防腐效果明顯，但若處理不當(dāng)，容易產(chǎn)生尖酸味道，導(dǎo)致果酒口味變差，嚴(yán)重的還會危害硫不耐癥及高敏人群的健康，甚至促使哮喘病患者舊疾復(fù)發(fā)[19]。為此，研究新的果酒殺菌技術(shù)或工藝，對提高果酒的安全性意義重大。WYK S等[20]研究了SO2處理、高壓處理和脈沖電磁場處理對紅葡萄酒的感官、酒香酵母活力和其他品質(zhì)參數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)在一年的貯藏過程中，高壓處理能保持酒中的微生物平衡，并對口感沒有顯著影響。FERRER-GALLEGO R等[21]采用復(fù)合的物理和化學(xué)添加劑（富含谷胱甘肽、殼聚糖、二甲基碳酸酯和不同水解縮合單寧組成的滅活干酵母組成）取代SO2加工生產(chǎn)西班牙著名的丹魄（Tempronillo）和阿爾巴里諾（Albari?o）無硫葡萄酒，結(jié)果表明，采用這種處理加工出的無硫葡萄酒可以滿足消費(fèi)者對健康葡萄酒的需求。也有采用臭氧、沙棘葉綠體方法[19]等來降低葡萄酒中亞硫酸鹽的殘留量的報道。本研究主要圍繞不同的殺菌方式（亞硫酸鹽、高壓殺菌、巴氏殺菌和高壓微射流（highpressuremicrofluidization，HPM））處理對棗酒發(fā)酵中各項品質(zhì)指標(biāo)的影響，以期為生產(chǎn)更為安全的發(fā)酵型低醇棗酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗（品種為灰棗）：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.137：廣東省微生物菌種保藏中心。

沒食子酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（100 000 U/g）、纖維素酶（200 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；麥芽汁培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸、2,2聯(lián)吡啶、N-乙基順丁烯二酰亞胺（N-ethylmaleimide，NEM）（均為分析純）：阿拉丁化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KYH-777多功能食品攪拌機(jī)：佛山市樂創(chuàng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；BC/BD-429H型冰柜：青島海爾股份有限公司；HC-3618R型高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SC-80C型全自動色彩色差計：北京康光光學(xué)儀器有限公司；PAL-1數(shù)顯折光糖度儀：日本Atago公司；PHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；BPH-9272型精密恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SHB-3循環(huán)水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵棗酒的工藝流程及操作要點(diǎn)

紅棗汁的酶解：紅棗經(jīng)清洗、去核后，切成小塊，按照料液比1∶6（g∶mL）進(jìn)行打漿（pH為5.31），將紅棗漿移入容器中，放入磁力攪拌器中（40℃），加入果膠酶和纖維素酶（質(zhì)量比1∶2）酶解4 h[22]。酶解后的棗漿采用200目的紗布進(jìn)行過濾，將過濾得到的棗汁于6 000 r/min的條件下，4℃離心20 min，收集上清液得到澄清棗汁（可溶性固形物含量為8%），灌裝于玻璃飲料瓶中，每瓶灌裝200 mL。

殺菌：分別采用巴氏殺菌（95℃、15 min）、高壓殺菌（115℃、10min）、超高壓微射流（160MPa，處理2次）和亞硫酸氫鈉殺菌（NaHSO3，60mg/L）4種殺菌方式處理棗汁，以不進(jìn)行殺菌處理的棗汁為對照，每種殺菌處理選用10瓶棗汁。

釀酒酵母的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)：在無菌條件下，取安瓿管保存的釀酒酵母凍干粉，滴入0.1～0.2 mL無菌水溶解，待安瓿瓶內(nèi)的菌粉溶解成懸浮狀，吸取全部菌懸液接入滅菌冷卻后的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在26℃培養(yǎng)24h后，取出，搖勻。移取此培養(yǎng)液1 mL，接入滅菌冷卻后的麥芽汁液體培養(yǎng)基（100 mL）中，在同樣條件下培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的釀酒酵母菌懸液（6.8×108CFU/mL），備用。

接種、發(fā)酵：殺菌處理結(jié)束后，每瓶接種1.5%的酵母菌培養(yǎng)液，于26 ℃進(jìn)行發(fā)酵，分別在發(fā)酵0、2 d、4 d、6 d和8 d時取出，進(jìn)行指標(biāo)的測定。

1.3.2 測定方法

pH值：采用pH計測定；酒精度：采用酒精比重計法測定。

紅棗汁的可滴定酸：參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》中的方法[23]。移取10 mL紅棗汁，置于150 mL錐形瓶中，加入煮沸冷卻至室溫的蒸餾水，加入2mL酚酞指示液，混勻后，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色30s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，記錄所消耗的體積。按下式計算：

式中：TA為樣品的酸度，°T；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V1為滴定時所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為空白實(shí)驗所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)體積，mL；100為100 mL試樣；V2為試樣的體積，mL；0.1為酸度理論定義NaOH的物質(zhì)的量濃度，mol/L。

色差：采用全自動色彩色差計測定紅棗汁的明亮度（L*值）和綠/黃值（a*值正值表示黃色，a*值負(fù)值表示綠色；b*正值表示黃色，b*負(fù)值表示藍(lán)色）。

抗壞血酸含量：按照參考文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行測定；總酚含量：按照參考文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行測定；多糖含量：按照參考文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)含量：按照參考文獻(xiàn)[27]的方法進(jìn)行測定。

感官評價：采用9分制的評分方法，邀請30名學(xué)生參照表1的感官評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品評，無記名打分。要求品評者分別從色澤、口感、香氣和整體接受性4個方面進(jìn)行評價。

表1 低醇棗酒的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of low-alcohol jujube wine

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌方式對發(fā)酵棗酒pH值和可滴定酸含量的影響

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時間的延長，棗酒的pH值逐漸下降，在發(fā)酵第8天時，采用HPM殺菌和巴氏殺菌的棗酒保持了較高的pH值（分別為4.17和4.16），顯著高于對照組（3.99）、高壓滅菌組（4.13）和NaHSO3組（3.96）（P＜0.05）。對照組和添加NaHSO3組的pH值下降較快，主要是由于對照組并未進(jìn)行滅菌處理，導(dǎo)致雜菌的出現(xiàn)污染了棗酒，促使pH值下降。而添加NaHSO3的棗酒，由于NaHSO3的加入，增加了發(fā)酵基質(zhì)的酸度，從而引起pH值的降低[28]。

由圖1B可知，低醇棗酒中可滴定酸的變化趨勢與pH值的變化趨勢呈對應(yīng)性關(guān)系。隨發(fā)酵時間的延長，可滴定酸含量逐漸升高，這與棗酒中的糖類成分被酵母菌發(fā)酵利用，代謝產(chǎn)生了酸類物質(zhì)有關(guān)。棗酒中的酸類物質(zhì)，部分來源于原料，另一部分來源于發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生，如草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等[14]。在發(fā)酵第6天和第8天時，對照組的可滴定酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），表明棗酒中可能滋生了產(chǎn)酸菌，從而導(dǎo)致可滴定酸含量的增加。而采用高壓殺菌和HPM處理的棗酒，其可滴定酸含量要顯著低于對照（P＜0.05）。采用巴氏殺菌和添加NaHSO3的棗酒，在發(fā)酵前4 d沒有顯著差異（P＞0.05）。第6天時，添加NaHSO3的棗酒可滴定酸含量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。表明添加NaHSO3的棗酒在發(fā)酵6d后，發(fā)酵基質(zhì)的酸度由于NaHSO3的加入而升高了，從而導(dǎo)致可滴定酸含量增高。依據(jù)發(fā)酵酒的生產(chǎn)原則，對于優(yōu)質(zhì)的原料SO2用量控制在40～60mg/L，霉變原料SO2用量控制在60～80mg/L，陳釀酒SO2用量則控制在20～30 mg/L[28]。有些果酒在釀造過程中，SO2需要分次添加，只添加一次可能控制不住雜菌的生長。因此，采用SO2抑菌的措施，要注意使用次數(shù)和用量的問題，否則可能會產(chǎn)生雜菌。

圖1 不同殺菌方式對發(fā)酵低醇棗酒pH值（A）和可滴定酸含量（B）的影響Fig.1 Effect of different sterilization methods on pH value(A)and titratable acid content(B)of fermented low-alcohol jujube wine

2.2 不同殺菌方式對發(fā)酵棗酒色差的影響

果酒的色澤一般與原料有直接的關(guān)系，棗酒的色澤主要呈暗紅色或略帶淺棕色，具體的色差值如表2所示。從棗酒的明亮度（L*）變化可以看出，在發(fā)酵過程中，經(jīng)高壓殺菌后發(fā)酵的棗酒，L*顯著低于其他組（P＜0.05）。表明高壓殺菌顯著降低了棗酒的明亮度，可能是由于在高溫高壓條件下，棗汁的還原糖和氨基酸發(fā)生了美拉德反應(yīng)，形成了褐色的物質(zhì)，從而導(dǎo)致棗酒明亮度下降。相比而下，采用HPM處理的棗汁，其L*值顯著高于其他各組（P＜0.05），表明HPM處理可以較好地保護(hù)棗酒的明亮度，這與吳順紅等[29]的研究結(jié)果相一致。

紅色度（a*）在發(fā)酵過程中呈逐漸升高的趨勢。其中，對照組的a*由發(fā)酵0天時的5.83升至10.67，表明未經(jīng)殺菌處理的棗酒a*變化較快，棗酒的色澤深，可能是由于酶促反應(yīng)的原因，使得棗酒發(fā)生了褐色物質(zhì)。采用高壓殺菌的棗酒，其a*略低于對照組，高溫高壓條件使得棗酒的a*值增高，而采用巴氏、NaHSO3和HPM處理的棗酒，在發(fā)酵過程中a*沒有顯著差異（P＞0.05）。

黃色度（b*）在棗酒發(fā)酵過程中也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。對照組和HPM組的b*變化不顯著，而采用NaHSO3殺菌的棗酒在發(fā)酵第6天后，b*值大幅增加。采用高壓和巴氏殺菌的在棗酒，b*有明顯增加（P＜0.05），表明熱殺菌顯著提高了棗酒的黃色度。

表2 不同殺菌方式對低醇棗酒色差值的影響Table 2 Effect of different sterilization methods on color difference value of low-alcohol jujube wine

2.3 不同殺菌方式對發(fā)酵棗酒營養(yǎng)成分的影響

低醇棗酒中仍含有紅棗中的主要營養(yǎng)成分，在經(jīng)過不同的殺菌處理和發(fā)酵之后，棗酒中營養(yǎng)成分變化如表3所示?？傮w來看，在經(jīng)過不同的殺菌處理后，棗酒中的總酚含量和多糖含量有所增加，而抗壞血酸和蛋白質(zhì)含量則有所降低。采用高壓殺菌、NaHSO3和HPM這3種殺菌方式，均可以提高總酚含量，是由于這些殺菌方式均可以提高棗酒中酚類物質(zhì)的溶解量。在發(fā)酵的前4d，棗酒中的多酚含量較高，之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，多酚類物質(zhì)含量有所下降。這與李旋等[13]報道的棗酒多酚類物質(zhì)在發(fā)酵后期，有略微下降的結(jié)果相一致。

表3 不同殺菌方式對低醇棗酒部分理化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of different sterilization methods on partial physical and chemical indexes of low-alcohol jujube wine

對棗酒中的多糖含量而言，無論是否采取殺菌處理，在發(fā)酵第2天，棗酒中的多糖含量都增加了，尤以對照組和高壓殺菌組的多糖含量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。紅棗汁含糖量高，在殺菌后多糖更易溶出，從而含量增加。據(jù)吳順紅等[29]報道，采用120 MPa的高壓微射流處理紅棗汁，可使紅棗汁的可溶性固形物含量提高約29.6%，是歸因于紅棗汁通過高壓微射流處理后，強(qiáng)烈的撞擊過程中瞬間生成巨大能量，使物料中的糖、維生素及礦物質(zhì)等大顆粒物質(zhì)破碎、降解。然而在后期的發(fā)酵過程中，多糖含量又有所降低，是因為酵母菌的生長消耗了糖類物質(zhì)。

抗壞血酸和蛋白質(zhì)含量在經(jīng)殺菌和發(fā)酵后均有所降低。高壓殺菌、巴氏殺菌和NaHSO3都引起了抗壞血酸的損失，而采用HPM殺菌后，棗酒中的抗壞血酸破壞較小。在發(fā)酵第8天，HPM組僅損失了7.67%的抗壞血酸，而高壓殺菌組則損失了18.71%。相似的，蛋白質(zhì)含量也表現(xiàn)出相同的趨勢。蛋白質(zhì)含量的降低主要是由于發(fā)酵過程中酵母菌消耗蛋白質(zhì)作為氮源，也有可能是蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)如單寧等結(jié)合生成沉淀[15]。采用HPM殺菌處理，在發(fā)酵第8天，棗酒中約90.40%的蛋白質(zhì)被保留，而高壓殺菌的棗酒中則僅保留了43.43%的蛋白質(zhì)。

2.4 不同殺菌方式對發(fā)酵棗酒酒精度的影響

作為低醇果酒，本研究中得到的低醇棗酒的酒精度約為2.00%vol～3.50%vol，要顯著低于其他被報道的果酒的酒精度含量[1，6，18]（P＜0.05）。這主要與發(fā)酵菌種、接種量和發(fā)酵條件有直接的關(guān)系。李希[8]采用4種不同的酵母菌發(fā)酵桑葚果酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌Z5發(fā)酵的桑椹酒酒精度最低（2.87%vol），而AQ1酵母發(fā)酵的桑椹酒酒精度高達(dá)7.01%vol。同時，當(dāng)接種量為3%時AQ1發(fā)酵的低醇桑葚酒酒精度顯著高于接種1%的樣品（P＜0.05）。低醇飲料的功效主要在于乙醇含量低，從而降低了乙醇造成的身體傷害，并且能保持原材料所獨(dú)有的原始風(fēng)味，同時也富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[5]。

圖2 不同殺菌方式對低醇棗酒酒精度含量的影響Fig.2 Effect of different sterilization methods on alcohol content of low-alcohol jujube wine

由圖2可知，酒精度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，對照組和巴氏殺菌組的酒精度增加的較少，可能是由于殺菌不徹底，導(dǎo)致釀酒酵母的發(fā)酵進(jìn)行的不完全。相比較而言，NaHSO3和HPM殺菌處理的棗酒的酒精度含量較高，在發(fā)酵第8天時，HPM處理的棗酒酒精度顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.5 不同殺菌方式對發(fā)酵棗酒感官評價的影響

以發(fā)酵第8天的棗酒為評價對象，參照表1的評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評價，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，采用HPM殺菌處理的樣品感官評分最高（7.62），其次為高壓殺菌的棗酒（7.15）。結(jié)果表明，采用HPM處理棗汁，后經(jīng)酵母菌發(fā)酵的棗酒感官評價優(yōu)于巴氏殺菌和NaHSO3處理的樣品。

圖3 不同殺菌方式對棗酒發(fā)酵第8天的感官評價影響Fig.3 Effect of different sterilization methods on sensory evaluation of low-alcohol jujube wine fermented for 8 d

3 結(jié)論

采用HPM殺菌處理對棗酒的pH和可滴定酸含量影響較小，對棗酒的明亮度和酒精度有顯著的提升效果，并且獲得了較高的感官評分。

棗酒發(fā)酵前的殺菌處理增加了棗酒中的總酚和多糖含量，卻降低了抗壞血酸和蛋白質(zhì)含量。與其他殺菌方式相比，采用HPM殺菌處理對抗壞血酸的損失最小。

HPM作為一種新型的高壓處理技術(shù)，目前在液態(tài)食品中的應(yīng)用還較少，尤其是用于殺菌處理方面的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，采用HPM處理能有效保持棗酒的營養(yǎng)成分，有望成為一種新的殺菌處理方式。