荊 雄，楊 輝*，蘇 文，董騰達，黃莎莎

（陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

我國柿子種植面積廣、產(chǎn)量高，特別是近年來柿子產(chǎn)量大幅度提高，而柿子鮮食消費市場卻相對有限，柿子成熟后一旦不及時采摘加工，很容易軟化、腐爛，造成極大經(jīng)濟損失[1]。由于柿子中具有豐富的生物活性物質（如甘露醇、果糖、五環(huán)三萜類化合物、維生素和大量的鞣質等），因此可以做成高檔調(diào)味品、柿子酒和各種保健品等[2-4]。

我國柿子酒的生產(chǎn)工業(yè)中多采用商用酵母單菌發(fā)酵，這類酵母具備耐高溫、耐高酒精的特征，可確保果酒品質[5]。但由于商用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產(chǎn)的果酒揮發(fā)性香氣物質含量較少，缺少酯香，導致口感和風味不佳，不能很好地滿足市場的需求[6]。隨著人們對葡萄酒研究的深入，王志恒等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒自然釀造過程中存在大量的非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），這些非釀酒酵母對葡萄酒風味物質的產(chǎn)生具有重要作用。非釀酒酵母是有別于釀酒酵母的一大類酵母，主要包括克勒克酵母屬（Kloeckera）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和伊薩酵母屬（Issatchenkia）等[8]。

與釀酒酵母相比，非釀酒酵母能產(chǎn)生更多種類的胞外酶將葡萄酒中的香氣前體物質分解從而釋放出香氣物質[9-11]，如能夠分泌蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等[12]。而水解香氣糖苷形成揮發(fā)性香氣成分的關鍵酶是β-葡萄糖苷酶[13]，β-葡萄糖苷酶具有獨特的水解活性，可以從香氣前體物質的末端非還原性β-D-糖苷鍵中釋放出非還原性糖基[14]，賦予葡萄酒更好的花香、果香味[15]。因此可以將在葡萄酒釀造中發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母引用到柿子酒的釀造中，以此提高柿子酒的質量。

目前我國對非釀酒酵母的研究尚處于起步階段，工業(yè)發(fā)酵菌株亟待開發(fā)。因此本研究選用兩種不同類型非釀酒酵母：檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），在對兩種非釀酒酵母耐受性研究的基礎上，對兩種非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵柿子酒的發(fā)酵特性進行研究，為非釀酒酵母在柿子酒生產(chǎn)中的應用奠定基礎，同時為其他果酒發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Z2：本實驗室提供，保藏方式為凍干粉；檸檬克勒克酵母（Klockera apiculata）31232、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）1344：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，提供方式為凍干粉。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（純度≥96%）：北京奧博星生物技術有限責任公司；檸檬酸、蔗糖（純度≥98%）：濰坊英軒實業(yè)有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、次甲基藍（純度≥98%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；單寧（純度≥98%）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

選擇培養(yǎng)基為YPD固體（yeast extract peptone agar，YPDA）培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基基礎上加2%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基為純柿子汁（經(jīng)過打漿、酶解、榨汁、調(diào)糖調(diào)酸得到），調(diào)整pH為4.0，將初始可溶性固形物調(diào)為20°Bx，還原糖含量為128.86 g/L，總酸含量為8.64 g/L。

上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計、78-1磁力攪拌器：上海儀電科學器股份有限公司；PL203電子天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；SP-756P紫外可見分光度計：上海光譜儀器有限公司；DSX-280B蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；WMK-08恒溫培養(yǎng)箱：山東濰坊醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取三種保藏的酵母凍干粉分別加入含有2%葡萄糖的無菌水中，37℃恒溫復水20 min；取2%的菌懸液接種至YPD培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)1 d，稀釋涂布于YPDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2d，在固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)2 d制成種子液，放于冰箱中保藏備用。

1.3.2 兩種非釀酒酵母對酒精的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別按2%接種量接種于酒精度為0、2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h，使用紫外可見分光光度計測定酵母菌液在波長630 nm處的OD630nm值。

1.3.3 兩種非釀酒酵母對單寧的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母分別按2%接種量接種于0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L不同單寧含量的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，通過血球計數(shù)板對酵母數(shù)量進行計數(shù)。

1.3.4 兩種非釀酒酵母對SO2的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別按2%接種量接種于SO2質量濃度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h之后，使用紫外可見分光光度計測定酵母菌液在波長630 nm處的OD630nm值。

1.3.5 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力試驗

將3種酵母分別梯度稀釋后涂布于以纖維二糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d后觀察酵母生長情況。

1.3.6 發(fā)酵性能試驗

將釀酒酵母和兩株非釀酒酵母分別單獨接種于柿子汁中，于25℃靜置培養(yǎng)7 d進行單菌發(fā)酵試驗；同時以相同發(fā)酵條件將兩株非釀酒酵母分別與釀酒酵母按照1∶1混合接種于柿子汁中進行混菌發(fā)酵試驗（其中混1表示檸檬形克勒克酵母與釀酒酵母，混2表示東方伊薩酵母與釀酒酵母）；每隔24 h取樣，測定單菌、混菌發(fā)酵過程培養(yǎng)基中還原糖、總酸、pH、酒精度等變化情況。

1.3.7 分析檢測

（1）發(fā)酵過程中理化指標的測定[16]：還原糖采用斐林試劑法測定；總酸采用電位滴定法測定；酒精含量采用密度瓶法。

（2）酵母發(fā)酵性能[17]：采用CO2失重法。每隔24h稱質量一次，直至發(fā)酵結束。

（3）酵母計數(shù)[18]：采用改良的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基：添加40 mg/L的溴酚藍，pH4.6。在該培養(yǎng)基上檸檬形克勒克酵母的菌落泛藍，東方伊薩酵母菌落呈藍色，且菌落較大，釀酒酵母則是白色微泛黃菌落，根據(jù)菌落形態(tài)特征的不同進行酵母計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 兩種非釀酒酵母對酒精的耐受性

兩種非釀酒酵母對酒精的耐受性結果見圖1。由圖1可知，當酒精度＞4%vol之后，檸檬形克勒克酵母生長嚴重受到抑制，而對東方伊薩酵母生長幾乎沒有影響；當酒精度＞8%vol之后，東方伊薩酵母生長開始受到抑制，而檸檬形克勒克酵母幾乎不能生長。由此可以得出，東方伊薩酵母相比于檸檬形克勒克酵母對酒精耐受性更好。

圖1 非釀酒酵母對酒精的耐受性Fig.1 Tolerance of non-Saccharomycesto ethanol

2.2 兩種非釀酒酵母對單寧的耐受性

由于柿子中單寧含量較高，單寧與蛋白質可發(fā)生沉淀反應，因而過高的單寧含量會對酵母的生長起到抑制作用。經(jīng)測定新鮮柿子經(jīng)過脫澀、酶解、榨汁處理后柿子汁中單寧含量在0.2～0.4g/L之間，兩種酵母對單寧的耐受性結果見圖2。由圖2可知，兩種非釀酒酵母在單寧添加量為0.1～0.5g/L時，酵母數(shù)量都有略微的下降，但菌體數(shù)量都能維持在108CFU/mL以上。因此，兩株非釀酒酵母在柿子汁中仍可以保持較高數(shù)量生長。

圖2 非釀酒酵母對單寧的耐受性Fig.2 Tolerance of non-Saccharomycesto tannin

2.3 兩種非釀酒酵母對SO2的耐受性

圖3 非釀酒酵母對SO2的耐受性Fig.3 Tolerance of non-Saccharomycesto SO2

在果酒的釀造過程中，需要加入少量的SO2來防止雜菌的污染，同時還能夠起到抗氧化及護色的作用[19]。SO2質量濃度對兩種酵母生長的影響結果見圖3。從圖3可知，兩種非釀酒酵母生長量隨著SO2質量濃度的增加都有所降低，但降低幅度都較?。辉赟O2質量濃度＜100 mg/L之前，酵母生長良好，有輕微抑制作用。

2.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力試驗

圖4為三種酵母經(jīng)過梯度稀釋涂布后在纖維二糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的生長情況，從圖中可以看出檸檬形克勒克酵母數(shù)量較多，能夠很好的利用纖維二糖進行生長，其次為東方伊薩酵母，釀酒酵母培養(yǎng)2 d后只有兩個酵母生長出來，并且酵母形態(tài)偏小，生長速度緩慢。從三種酵母在纖維二糖培養(yǎng)基上的生長情況可以得出，檸檬形克勒克酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力最強，其次為東方伊薩酵母，釀酒酵母最弱。

圖4 酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力Fig.4 The β-glucosidase producing ability of yeasts

2.5 發(fā)酵性能試驗

2.5.1 發(fā)酵過程中還原糖和酒精度變化

兩種酵母在發(fā)酵過程中還原糖和酒精度變化結果見圖5。

由圖5（A）可知，不同發(fā)酵方式下發(fā)酵液中還原糖含量的變化，無論是釀酒酵母單菌發(fā)酵還是與非釀酒酵母混合菌發(fā)酵，在發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中還原糖消耗殆盡，而兩種非釀酒酵母在發(fā)酵結束后發(fā)酵液中還原糖含量都保持較高水平，檸檬形克勒克酵母殘?zhí)橇孔罡?。由圖5（B）可知，不同發(fā)酵方式下發(fā)酵液中酒精度的變化，其中發(fā)酵結束后釀酒酵母單菌發(fā)酵酒精度最高達到11%vol，檸檬形克勒克酵母和東方伊薩酵母產(chǎn)酒精能力較弱，分別為3.05%vol和4.51%vol，與圖5（A）中對還原糖的利用結果相一致。單純釀酒酵母、非釀酒和釀酒酵母混合菌種發(fā)酵中由于有釀酒酵母的存在可使還原糖降到很低，所得酒的酒精度高于非釀酒酵母發(fā)酵的酒精度?；旌辖湍赴l(fā)酵將非釀酒酵母増香提升酒的品質與釀酒酵母的高效率發(fā)酵結合起來，可釀造出酒度高香氣豐富的高品質發(fā)酵酒。

圖5 發(fā)酵過程中還原糖含量（A）和酒精度（B）變化Fig.5 Changes of reducing sugar(A)and alcohol content(B)during fermentation process

2.5.2 發(fā)酵過程中pH和總酸變化

圖6 發(fā)酵過程中pH（A）和總酸含量（B）變化Fig.6 Changes of pH(A)and total acid content(B)during fermentation process

發(fā)酵醪液的pH或酸度是影響酵母發(fā)酵活力的重要因素之一，發(fā)酵過程中pH的變化對酵母活力有一定的影響，發(fā)酵過程中pH變化如圖6（A）所示，在發(fā)酵起始階段，由于釋放出來的二氧化碳較少，可能有部分二氧化碳溶解于醪液中，同時發(fā)酵初期酵母形成乙酸等酸性物質，導致pH下降，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵速率加快，酒精度不斷上升，釀酒酵母單菌和混菌發(fā)酵液pH逐漸上升，直至最后發(fā)酵趨于穩(wěn)定，其pH也趨于穩(wěn)定。由圖6（B）可知，在發(fā)酵前2 d總酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢，與圖6A中pH變化相一致；之后在酒精發(fā)酵過程中酵母能夠產(chǎn)酸同時也具備分解有機酸的能力，使得總酸含量出現(xiàn)上下波動的趨勢，直至發(fā)酵結束釀酒酵母發(fā)酵柿子酒醪液中總酸含量最低，說明釀酒酵母分解有機酸能力較非釀酒酵母強。

2.5.3 發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化

圖7 單菌發(fā)酵（A）及混合菌發(fā)酵（B）過程中酵母數(shù)量的變化Fig.7 Changes of yeast number during single strain fermentation(A)and mixed fermentation(B)

由圖7（A）可知，三種酵母單菌發(fā)酵過程中，在發(fā)酵24 h內(nèi)酵母數(shù)量均呈指數(shù)倍增長，其中釀酒酵母發(fā)酵性能最好，酵母數(shù)量最高；之后隨著發(fā)酵的進行，酵母數(shù)量都能保持在一定水平。由圖7（B）可知，在混菌發(fā)酵中，發(fā)酵初期由于非釀酒酵母與釀酒酵母競爭利用營養(yǎng)物質，使得酵母數(shù)量都低于酵母單菌發(fā)酵；發(fā)酵48 h后混1中檸檬形克勒克酵母數(shù)量開始急劇下降，直到發(fā)酵結束酵母基本上全部衰亡；混2中東方伊薩酵母數(shù)量也出現(xiàn)下降，但到發(fā)酵結束仍有一定數(shù)量東方伊薩酵母存在，這是由于隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中酒精濃度逐漸升高，而東方伊薩酵母酒精耐受性較檸檬形克勒克酵母好，所以酵母存活數(shù)量多。

2.5.4 酵母發(fā)酵性能的測定

酵母發(fā)酵會產(chǎn)生大量的二氧化碳，通過對發(fā)酵過程中二氧化碳釋放量的測定來確定酵母的發(fā)酵性能，結果見圖8。由圖8可知，釀酒酵母單菌發(fā)酵性能最好，略高于兩種混菌發(fā)酵方式，在發(fā)酵前5 d可以觀察到瓶中有大量氣泡產(chǎn)生，二氧化碳釋放量達到106.55 g/L；兩種非釀酒酵母發(fā)酵性能較差，產(chǎn)生氣泡較少，其中檸檬形克勒克酵母單菌發(fā)酵性能最差，直致發(fā)酵結束二氧化碳釋放量才達到57.96g/L。

圖8 酵母發(fā)酵曲線Fig.8 Fermentation curves of yeasts

3 結論

通過對兩種非釀酒酵母耐受性、產(chǎn)酶和發(fā)酵特性的研究，發(fā)現(xiàn)東方伊薩酵母的耐受性優(yōu)于檸檬形克勒克酵母，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較檸檬形克勒克酵母差；三種酵母進行單菌發(fā)酵，釀酒酵母發(fā)酵性能最好，產(chǎn)酒精能力強；兩種非釀酒酵母均不能單獨完成發(fā)酵，在混合發(fā)酵前期與釀酒酵母具有相互競爭作用，但之后非釀酒酵母漸漸衰亡，對釀酒酵母的發(fā)酵的影響減弱，但對最終發(fā)酵酒精度幾乎沒有影響。

采用不同的接種方式將非釀酒酵母引入酒精發(fā)酵過程，在發(fā)酵結束后得到了不同風味的果酒，其中有克勒克酵母參與發(fā)酵的柿子酒酒體具有較濃的果香味，香味物質比較復雜，對此，后期研究可通過對發(fā)酵液中風味物質的種類和含量進行分析，以便了解非釀酒酵母對果酒増香和品質提升的深層次原因。