陳申如，魏配曉，葉燕軍，陳 俊,2，翁武銀,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實驗室，福建 廈門 361021）

福建鮑魚資源豐富，養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全國鮑魚總產(chǎn)量的80%[1]。伴隨著消費(fèi)者飲食觀念的改變和市場的需求，干鮑、冷凍蒸煮鮑和罐頭鮑等鮑魚加工產(chǎn)品逐漸增加。在鮑魚加工過程中，必然會產(chǎn)生約占鮑魚質(zhì)量25%的內(nèi)臟。鮑魚以攝食海藻和浮游生物為生，內(nèi)臟富含蛋白、多糖、脂質(zhì)、微量元素和各種活性代謝物。因此，近年來有關(guān)鮑魚內(nèi)臟活性成分的研究逐漸受到關(guān)注。鮑魚內(nèi)臟不僅含有豐富的?；撬醄2]，而且鮑魚內(nèi)臟酶解物及其膜分離組分、鮑魚內(nèi)臟多糖均具有良好的抗氧化活性[3-5]。具有抗氧化活性的寡肽能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的增殖[6-7]。有研究報道，鮑魚內(nèi)臟蛋白多糖可能通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能抑制H22肝癌，鮑魚內(nèi)臟蛋白肽在一定程度上能抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖[8-9]。然而，有關(guān)利用鮑魚內(nèi)臟提取蛋白肽對乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響卻鮮見報道。

乳腺癌是全球女性最常見惡性腫瘤之一，近年來隨著環(huán)境、生活方式的改變及人口老齡化加劇，我國女性人群乳腺癌患病率也呈上升趨勢[10]。然而，越來越多的研究資料表明，從食品加工副產(chǎn)物中提取的營養(yǎng)物質(zhì)也可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[11-13]。因此，本實驗以鮑魚內(nèi)臟為原料，通過蛋白酶解、膜分離技術(shù)制備蛋白肽，并以不同質(zhì)量濃度鮑魚肽處理人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞，考察細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)和作用機(jī)制，為利用鮑魚內(nèi)臟制備蛋白肽、開發(fā)輔助抗腫瘤功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內(nèi)臟由廈門市島之原生物科技有限公司提供。

人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231細(xì)胞） 中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%） 美國Corning公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Calcein-AM細(xì)胞活性分析試劑盒 南京建成生物工程有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國MP生物科技有限公司；臺盼藍(lán)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000A型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Forma 702二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；EVOS型倒置顯微鏡 美國AMG公司；Cytoflex流式細(xì)胞儀 中國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；Series II Water Jaket酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 鮑魚肽的制備

在鮑魚內(nèi)臟中，按照料液比為1∶5加入蒸餾水，搗碎，加入鮑魚內(nèi)臟質(zhì)量2‰的胰酶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaOH溶液調(diào)整pH值至8.0，50 ℃條件下酶解6 h，然后用體積分?jǐn)?shù)1% HCl溶液將酶解液的pH值調(diào)整至5.5，加入鮑魚內(nèi)臟質(zhì)量1‰的木瓜蛋白酶，在50 ℃條件下繼續(xù)酶解12 h。酶解液利用100 ℃滅酶10 min，將離心（8 000 r/min，10 min）獲得的上清液利用截留分子質(zhì)量為1 000 Da超濾膜進(jìn)行超濾，獲得的濾液再利用200 Da納濾膜進(jìn)行脫鹽濃縮，獲得200～1 000 Da的濾液組分通過冷凍干燥制備成鮑魚肽，備用。

1.3.2 鮑魚肽基本組分的測定

蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25；碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》的苯酚-硫酸法進(jìn)行測定；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用GB/T 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》的高溫灼燒法進(jìn)行測定；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GB/T 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》的直接干燥法進(jìn)行測定。

1.3.3 鮑魚肽分子質(zhì)量分布的測定

蛋白肽的分子質(zhì)量分布參考Weng Wuyin等[14]報道的方法進(jìn)行測定，利用凝膠滲透色譜進(jìn)行測定。色譜柱為TSKgel G2000 SWxL（300 mm×7.8 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-三氟乙酸（體積比45∶55∶0.1），在柱溫30 ℃、流速0.5 mL/min的條件下，以檢測波長為214 nm對樣品進(jìn)行測定。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[13]的方法，將MDA-MB-231細(xì)胞在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% FBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞融合率達(dá)90%時，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞供以下實驗使用。

1.3.5 細(xì)胞存活率測定

細(xì)胞存活率參考Oh等[15]報道的方法進(jìn)行測定。MDA-MB-231細(xì)胞以5×104個/孔接種于96 孔板中，放在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液并加入含不同質(zhì)量濃度鮑魚肽的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL MTT（0.5 mg/mL）染色，于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后移去培養(yǎng)液，加入110 μL DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測各孔的吸光度，按照下式計算細(xì)胞存活率。

1.3.6 Calcein-AM染色

Calcein-AM染色參照Haorah等[16]報道的方法進(jìn)行測定。按1.3.4節(jié)的實驗方法，細(xì)胞經(jīng)過含不同質(zhì)量濃度鮑魚肽的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL Calcein-AM溶液（2 μmol//L），避光室溫反應(yīng)20 min后，置于熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞情況。

1.3.7 細(xì)胞凋亡檢測

按照試劑盒操作說明書，以Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。按1.3.4節(jié)方法，細(xì)胞經(jīng)過含不同質(zhì)量濃度鮑魚肽的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% AnnexinV-FITC和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% PI溶液的工作液，避光室溫反應(yīng)10 min后，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 細(xì)胞周期檢測

按照試劑盒操作說明，以PI單染法對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。按1.3.4節(jié)的實驗方法，細(xì)胞經(jīng)過含不同質(zhì)量濃度鮑魚肽的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，用胰酶消化，磷酸鹽緩沖液洗滌，離心（1 000 r/min、5 min）收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的無水乙醇進(jìn)行固定，-20 ℃過夜，再通過離心（1 000 r/min、5 min）并用磷酸鹽緩沖液洗去乙醇后，加入核糖核酸酶A和PI染色液，在37 ℃下避光水浴30 min后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，并用軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著（P＜0.05）采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑魚肽的理化性質(zhì)

鮑魚內(nèi)臟經(jīng)蛋白酶解、超濾和納濾制備成淡黃色的蛋白肽，其基本成分經(jīng)檢測為：蛋白質(zhì)（71.62±1.23）%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、碳水化合物（3.38±0.04）%、灰分（11.48±2.38）%、水分（6.41±0.18）%。蛋白肽除了主要成分蛋白以外，還含有少量碳水化合物，表明鮑魚內(nèi)臟中的蛋白經(jīng)胰酶和木瓜蛋白酶酶解后形成的小肽能透過1 000 Da超濾膜，而多糖幾乎都被超濾膜截留。通常，納濾處理不僅具有濃縮效果，還可起到良好的脫鹽效果。周鳳娟等[17]利用納濾設(shè)備進(jìn)行絲素蛋白酶解液進(jìn)行脫鹽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干燥后的絲素肽中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.34%。然而，在本研究中鮑魚內(nèi)臟酶解液雖然經(jīng)過納濾膜處理，但是在獲得鮑魚肽中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻高達(dá)11.48%，表明鮑魚肽對礦物質(zhì)元素具有良好的螯合能力。

圖1 鮑魚肽的分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular mass distribution of peptides derived from abalone viscera

分子質(zhì)量檢測的結(jié)果顯示，鮑魚肽中蛋白分子質(zhì)量主要分布在350～1 000 Da范圍內(nèi)，豐度較高的蛋白肽分子質(zhì)量分布在350 Da 附近（圖1），表明獲得的鮑魚肽主要是由2～3 個氨基酸殘基組成的小肽。據(jù)報道，寡肽尤其二肽或三肽容易穿越小腸黏膜被人體吸收利用[18-19]。因此，本研究制備的鮑魚肽也可能有效地被人體吸收，從而發(fā)揮其生物活性功能。

2.2 鮑魚肽對細(xì)胞存活率的影響

圖2 鮑魚肽對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of peptides derived from abalone viscera on cell viability of MDA-MB-231 cells

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)液中鮑魚肽質(zhì)量濃度的增加，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的存活率呈下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)液中鮑魚肽的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞存活率只有45%左右。這些結(jié)果表明，鮑魚肽對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用顯著（P＜0.05），而且呈劑量依賴性。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖3 MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Morphological change of MDA-MB-231 cells

如圖3所示，在自然光條件下觀察時，可以發(fā)現(xiàn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在未添加鮑魚肽的培養(yǎng)基中貼壁良好，呈梭形分布。伴隨培養(yǎng)基中鮑魚肽質(zhì)量濃度的增加，貼壁細(xì)胞逐漸減少，且部分細(xì)胞出現(xiàn)染色加深（細(xì)胞核濃縮）、回縮變圓等現(xiàn)象。這與Mirakabadi等[20]報道的利用蛇蝎毒液提取的肽抑制MDA-MB-231細(xì)胞時的現(xiàn)象一致。另一方面，在熒光條件下觀察到的鮑魚肽質(zhì)量濃度對MDA-MB-231活細(xì)胞形態(tài)的影響與自然光條件的趨勢一致，只是在熒光條件下更清晰。不管是在自然光條件下還是在熒光條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中含有的鮑魚肽質(zhì)量濃度不小于4 mg/mL時，視野內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)目（圖3）明顯低于MTT法檢測的數(shù)據(jù)（圖2）。MTT法檢測細(xì)胞存活率是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原MTT生成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，在490 nm波長處檢測溶解在二甲基亞砜中的甲瓚[21]。琥珀酸脫氫酶活性除了與活細(xì)胞數(shù)量有關(guān)外，還與外界干預(yù)后細(xì)胞的狀態(tài)有關(guān)[22]。在細(xì)胞晚期凋亡和壞死情況下，線粒體的功能都受損，會導(dǎo)致MTT檢測的吸光度偏低[23]。因此，鮑魚肽對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的實際抑制效果應(yīng)該高于MTT法檢測的結(jié)果。

2.4 鮑魚肽對細(xì)胞凋亡的影響

在流式Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)中，I、III、II和IV象限分別代表機(jī)械損傷細(xì)胞、活細(xì)胞、晚期凋亡/壞死細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞[24]。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，對照組的MDA-MB-231細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別為1.96%和4.05%，而1、2、4、8 mg/mL鮑魚肽處理48 h的MDA-MB-231細(xì)胞早期凋亡率分別為12.01%、21.43%、5.09%和1.96%；晚期凋亡率分別為14.74%、32.25%、48.33%和72.65%。這表明鮑魚肽能誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出明顯的質(zhì)量濃度梯度依賴性。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptosis rates of MDA-MB-231 cells determined by flow cytometry

2.5 鮑魚肽對細(xì)胞周期的影響

利用流式細(xì)胞儀對不同質(zhì)量濃度鮑魚肽處理的MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測。隨著鮑魚肽的質(zhì)量濃度的增加，可以發(fā)現(xiàn)G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)增加，G2期細(xì)胞數(shù)在鮑魚肽質(zhì)量濃度8 mg/mL條件下顯著增加（圖5），表明鮑魚肽主要將MDA-MB-231細(xì)胞阻滯在S期，從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的目的。通常，細(xì)胞從一次分裂完成到下一次分裂開始一般會經(jīng)歷細(xì)胞間期（G1期、S期和G2期）和分裂期。一旦細(xì)胞進(jìn)入分裂期，細(xì)胞周期就會不可逆轉(zhuǎn)地進(jìn)行下去。有研究表明，小肽可以進(jìn)入癌細(xì)胞，激活抗癌基因p53，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[25]。低分子質(zhì)量的小肽，可以調(diào)動、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤機(jī)制，減弱、抑制促腫瘤生長機(jī)制，進(jìn)而抑制腫瘤的生長繁殖[26]。而且，小肽中的陽離子會與癌細(xì)胞細(xì)胞膜的陰離子發(fā)生特異性的結(jié)合，從而使細(xì)胞發(fā)生裂解[27]。因此，MDA-MB-231細(xì)胞周期被阻滯在S期說明細(xì)胞DNA合成受抑制或DNA損傷無法得到修復(fù)，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行分裂增殖（圖2）。

圖5 鮑魚肽對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of peptides derived from abalone viscera on cell cycle in MDA-MB-231 cells

近年來，鮑魚內(nèi)臟的綜合利用和活性物質(zhì)提取的研究，日益引起各國學(xué)者的關(guān)注。有研究表明，鮑魚內(nèi)臟酶接物中苯丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸等具有抗氧化活性的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以高達(dá)57.1%，它們可以通過清除細(xì)胞內(nèi)的自由基保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[28]。鮑魚內(nèi)臟酶接物通過系列凝膠層析分離可以獲得具有良好抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的三肽（Ala-Met-Asn）[29]。黑鮑內(nèi)臟酶解物經(jīng)過FPLC分離后可以獲得具有抗血栓和抗凝血功能的活性物質(zhì)[30]。然而，有關(guān)鮑魚內(nèi)臟制備的蛋白肽對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的研究卻鮮見報道。因此，本研究的結(jié)果將為鮑魚內(nèi)臟的高值化利用拓展新的應(yīng)用范圍。

3 結(jié) 論

本研究利用鮑魚內(nèi)臟，通過酶解、超濾和納濾制備成淡黃色的鮑魚肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的蛋白肽中還含有少量的碳水化合物和高含量的礦物質(zhì)。以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為模型，研究了制備的鮑魚肽的抗增殖活性和促細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果表明鮑魚肽對MDA-MB-231細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，鮑魚肽能顯著誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞周期發(fā)生了變化，主要被阻滯在S期和G2期，進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。本研究的結(jié)果表明，鮑魚內(nèi)臟可以用于研發(fā)具有輔助抗腫瘤功能的蛋白肽產(chǎn)品。