吳隆坤，江連洲，王麗娟，肖志剛,*

（1.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蓮子由于其蛋白含量高、必需氨基酸比例平衡，同時又富含賴氨酸，可以彌補(bǔ)谷類蛋白質(zhì)中賴氨酸含量的不足，因此是一種理想、潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，也是制備降血壓肽的原料，近幾年利用蓮子蛋白制備功能型肽備受關(guān)注[1]。為了更好地制備功能型肽，提高其功能特性，通常對蓮子蛋白進(jìn)行酶解，酶解后的小分子肽吸收率優(yōu)于未經(jīng)酶解的蛋白，而且具有生理調(diào)節(jié)和預(yù)防疾病的生物活性功能，如血管緊張素I-轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性肽[2]。但是，常規(guī)酶解存在酶解效率低、生產(chǎn)成本較高等缺點。超聲預(yù)處理下蛋白質(zhì)酶解已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的效果，包括提高酶解速度、酶利用率和增加肽生物活性[3]。

近年來，有較多關(guān)于超聲輔助蛋白酶解的研究。Jin Jian等[4]研究了超聲預(yù)處理對油菜籽蛋白酶解結(jié)構(gòu)特征，熒光光譜發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理能夠誘導(dǎo)蛋白分子展開，引起更多的疏水性基團(tuán)和區(qū)域暴露；同時發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理是蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生多肽的有效方法。Pan Adan等[5]發(fā)現(xiàn)在超聲波參數(shù)中，超聲頻率是影響酶解的主要因素。由于超聲頻率對蛋白酶解的重要性，最近有研究者利用不同模式的超聲預(yù)處理對蛋白酶解效果的影響：Xue Yang等[6]以蛋白水解度和ACE抑制率為指標(biāo)，研究了多頻率超聲預(yù)處理對酶解后大米蛋白結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)不同模式的超聲預(yù)處理ACE抑制率差異較為明顯，且三頻超聲ACE抑制效果最為顯著；同時Xue Yang等[7]利用多頻率超聲預(yù)處理小麥胚芽蛋白，發(fā)現(xiàn)ACE抑制率及蛋白水解度具有類似的規(guī)律，同時還發(fā)現(xiàn)在不同模式的超聲預(yù)處理條件下，酶解對小麥胚芽的氨基酸組成發(fā)生了很大的變化。雖然前人發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理可以提高植物蛋白的酶解效率，但是目前對超聲預(yù)處理對蓮子蛋白酶解影響的研究較少，利用不同模式超聲預(yù)處理蓮子蛋白酶解更是鮮有研究，而分析蓮子蛋白酶解及結(jié)構(gòu)特征是獲取ACE抑制肽、提高蓮子蛋白功能特性的有效途徑。

為了探究不同模式、不同頻率的超聲預(yù)處理對蓮子蛋白酶解及結(jié)構(gòu)影響，本實驗采用不同模式下的超聲頻率（單頻、雙頻、三頻），以蛋白水酶解度與ACE抑制率作為指標(biāo)，選取最優(yōu)的超聲頻率；通過蛋白表面疏水性、氨基酸分析及內(nèi)源性熒光光譜對不同模式超聲預(yù)處理下的酶解物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為蓮子蛋白的應(yīng)用提供依據(jù)與應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空心白蓮由湖南宏興隆湘蓮食品有限公司生產(chǎn)，于37 ℃下干燥，制成蓮子粉（粒徑為0.150 mm）；木瓜蛋白酶（8 214 U/g） 廣西南寧龐博生物工程公司；HCl、NaOH、丙酮等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 廣州儀科實驗儀器有限公司；水浴鍋德國IKA公司；PHS-25數(shù)顯臺式酸度計 上海雷磁儀器廠；Allegra64R臺式高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；JXP-24型多頻組合超聲儀 北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀、F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 多頻率超聲預(yù)處理

蓮子粉用0.1 mol/L的NaCl溶液溶解，在45 ℃的恒溫水浴鍋中提取1 h，提取液4 000 r/min離心分離15 min，離心后用0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)上清液pH值至4.2，得蓮子蛋白液，將蛋白液冷凍干燥得到蛋白粉末[8]。多頻功率超聲儀配有6 個頻率發(fā)生器，分別為20、28、35、40、50 kHz和60 kHz，它可以在單頻超聲、雙頻超聲和三頻超聲模式下工作。配制底物質(zhì)量濃度60 g/L的蓮子蛋白溶液3 L，將超聲探頭以固定深度插入反應(yīng)液，水浴溫度30 ℃下分別在單頻、雙頻和三頻超聲模式下，超聲功率密度100 W/L、總電功率100 W工作超聲處理一定時間，然后進(jìn)行酶解，將ACE抑制率和水解度設(shè)定為優(yōu)化超聲頻率和工作模式的指標(biāo)。在相同條件下用不帶超聲波的磁力攪拌裝置處理的蓮子蛋白溶液作為空白對照[9]。所有實驗均重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.3.2 酶解蓮子蛋白的制備

超聲波預(yù)處理后，蓮子蛋白懸浮液在50 ℃下用水浴預(yù)熱10 min，將pH值調(diào)節(jié)至8.0。然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%木瓜蛋白酶，同時用2 mol/L NaOH溶液連續(xù)滴定，pH值保持在8.0，持續(xù)60 min。在酶解結(jié)束時，將混合物在水浴中煮沸10 min滅酶。冷卻至室溫后，將水解物以4 500 r/min離心10 min，并將上清液用于之后的分析[10]。

1.3.3 水解度的測定

參考Adler-Nissen[11]的方法略作修改，利用0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋蓮子蛋白質(zhì)得到質(zhì)量濃度為15 mg/mL的蛋白溶液，取10 μL稀釋后的蛋白溶液，加入含有1.5 mL OPA試劑的石英管中，漩渦混合2 s，之后避光5 min，最后在340 nm波長處測定吸光度。實驗重復(fù)3 次取平均值，每次測量均以去離子水作為空白樣品，水解度按式（1）計算。

式中：h為水解的肽鍵數(shù)/（mmol/g）；htot為總肽鍵數(shù)/（mmol/g）。

1.3.4 ACE抑制活性的測定

參照Cushman等[12]的方法，略作改動，量取80 μL蓮子蛋白酶解物加入到200 μL 5 mmol/L馬尿酰-組氨酸-亮氨酸四水化合物（N-hippury-His-Leu tetrahydrate，HHL），37 ℃恒溫水浴10 min。加入10 μL ACE（0.1 U）啟動反應(yīng)，37 ℃恒溫60 min后，加入0.25 mL 1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，再加入1.2 mL冷乙酸乙酯，混合均勻15 s，然后在3 500 r/min離心10 min，取出1.0 mL酯層放入另一試管中，在95 ℃的烘箱中處理30 min烘干，再將其溶于3.0 mL去離子水中，漩渦混合2 min，最后在228 nm波長處測定OD值。酶活力單位定義：在37 ℃、1 min內(nèi)催化HHL形成1 μmol馬尿酸所需的酶量計為1 個酶活力單位。ACE抑制率按式（2）計算。

式中：ODa為不含抑制劑時的光密度值；ODb為含有抑制劑與酶時的光密度值；ODc為空白對照的光密度值。

1.3.5 表面疏水性測定

參照Kato等[13]的方法，采用8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法。利用0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋蓮子蛋白質(zhì)得到質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的蛋白溶液，然后在90 000×g下離心40 min，取上清液利用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度，并用上述pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度0.005～0.500 mol/mL的蛋白溶液，然后取5 mL稀釋后的蛋白溶液，分別加入40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液，經(jīng)漩渦振蕩2 s后靜置5 min，最后測定樣品的熒光強(qiáng)度。設(shè)置的實驗參數(shù)：激發(fā)波長λex＝390 nm、發(fā)射波長λem＝468 nm、夾縫為5 nm、掃描速率10 nm/s。以得到的熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 氨基酸組成分析

采用氨基酸全自動分析儀酸水解法測定，取適量樣品中加入6 mol/L HCl溶液并封管，放入110 ℃烘箱中水解22 h，待反應(yīng)結(jié)束后，酶解液用0.45 μm濾膜過濾到50 mL容量瓶，用去離子水定容。然后取1 mL酶解液進(jìn)行濃縮、復(fù)溶，重復(fù)5 次后過濾進(jìn)樣，進(jìn)樣量50 μL。測定蓮子蛋白酶解物中氨基酸含量[14]。

1.3.7 熒光光譜分析

采用F-4500熒光分光光度計測定不同模式超聲預(yù)處理下蓮子蛋白酶解物的內(nèi)源性熒光光譜，即氨基酸熒光光譜。將蓮子蛋白酶解物用0.01 mol/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液，配制成質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的蛋白溶液。熒光光譜分析實驗設(shè)置：以蓮子蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，熒光光譜激發(fā)波長為290 nm，發(fā)散光譜掃描范圍為300～500 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。重復(fù)掃描3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗均重復(fù)3 次，采用ANOVA進(jìn)行誤差分析，并用Origin 7.5和Excel軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并作圖，采用Duncan檢驗法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同模式、不同頻率超聲預(yù)處理對蓮子蛋白酶解物水解度和ACE抑制率的影響

圖1 不同模式、不同頻率超聲預(yù)處理對蓮子蛋白酶解物水解度和ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of ultrasound pretreatment with different working modes and different frequencies on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of lotus seed protein hydrolysates

ACE抑制肽是一種具有降血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、抗氧化等特效的功能肽[15]；在制備酶解肽時，除了要考慮ACE活力抑制效果，還要研究酶解過程中產(chǎn)生的有效蛋白肽即測定酶解肽的水解度[16]。按照1.3.3和

1.3.4 節(jié)水解度及ACE抑制率的測定方法，得到了ACE的抑制率及蛋白水解度隨不同頻率超聲預(yù)處理的變化趨勢。如圖1A～C所示，所有超聲預(yù)處理均提高了蓮子蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率及水解度。同時也發(fā)現(xiàn)不同頻率超聲預(yù)處理下，蓮子蛋白水解度間總體差異不顯著（P＞0.05），這與Pan Adan等[5]研究結(jié)果相似。圖1A顯示在20～60 kHz的范圍內(nèi)，與空白對照相比，單頻超聲預(yù)處理均提高了蓮子蛋白水解液的ACE抑制率，且在20 kHz超聲頻率下獲得最高的ACE抑制率。這可能是由于20 kHz預(yù)處理使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使其更適合隨后的酶解。圖1B為雙頻率超聲預(yù)處理對蓮子蛋白水解產(chǎn)物的影響，結(jié)果顯示，雙頻超聲預(yù)處理下，蓮子蛋白的ACE抑制率顯著增加（P＜0.05），并在20/35 kHz的頻率組合下達(dá)到峰值。三頻超聲預(yù)處理下蓮子蛋白的ACE抑制率又進(jìn)一步增加，但所有頻率組合之間差異顯著（P＜0.05），與其他組合的三頻超聲預(yù)處理相比，20/35/50 kHz組合呈現(xiàn)較高的ACE抑制率（圖1C）。因此得出結(jié)論，所有的超聲預(yù)處理均增加了蓮子蛋白水解產(chǎn)物的ACE抑制率，且效果由大到小依次為：三頻＞雙頻＞單頻，對于蓮子蛋白而言，最優(yōu)頻率是20 kHz或其組合，這可能是由于每種蛋白都有使蛋白內(nèi)部的分子鏈展開的頻率[17]，即敏感頻率或組合，20 kHz是蓮子蛋白的敏感頻率[6]。

2.2 表面疏水性分析

圖2 不同模式超聲預(yù)處理對蓮子蛋白酶解物表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ultrasound pretreatment with different working modes on surface hydrophobicity of lotus seed protein hydrolysates

表面疏水性是蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的重要表征，也是反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)之一[18]。Jin Jian等[19]研究表明表面疏水性與疏水性氨基酸含量有關(guān)，這在肽的抗高血壓活性中起重要作用。不同模式超聲預(yù)處理下酶解后蓮子蛋白的表面疏水性如圖2所示。未處理的樣品表面疏水性最低，這與Hayakawa等[20]的研究結(jié)果一致，未經(jīng)超聲處理的蓮子蛋白中大多數(shù)疏水基團(tuán)被緊密包埋在球狀區(qū)域內(nèi)，蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)和熒光探針之間的接觸受到抑制，疏水性較低。超聲預(yù)處理均顯著提高蓮子蛋白的表面疏水性，主要是由于超聲作用使蛋白展開，使最初被掩埋在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)展開暴露[20]。另外，蛋白質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)在超聲波空化作用下被破壞，且超聲強(qiáng)度越大蛋白質(zhì)被破壞程度越大，蛋白質(zhì)的表面疏水性隨著蛋白質(zhì)分子拉伸而增加[21]，因此出現(xiàn)了如圖2所示結(jié)果，隨著超聲頻率組合的增多（三頻＞雙頻＞單頻）表面疏水性越來越大。這與不同頻率超聲預(yù)處理下，蓮子蛋白酶解物的ACE抑制率變化趨勢一致（圖1A～C），推測主要是由于超聲預(yù)處理使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，疏松的蛋白結(jié)構(gòu)在酶解過程中導(dǎo)致大量的疏水氨基酸被釋放，提高了蓮子蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率[22]。這也與2.3節(jié)疏水氨基酸的研究結(jié)果一致。

2.3 氨基酸組成分析

表1 不同模式超聲預(yù)處理下蓮子蛋白酶解后氨基酸組成Table1 Amino acid compositions of lotus seed protein hydrolysates obtained by ultrasound pretreatment with different working modes

不同模式超聲預(yù)處理條件下的蓮子蛋白氨基酸組成如表1所示。可以看出，超聲預(yù)處理明顯提高了蛋白質(zhì)中Ile、Try、Phe、Leu、Val、Ala等的含量，Ile、Leu、Phe、Val均為疏水氨基酸，且發(fā)現(xiàn)隨著超聲預(yù)處理頻率組合增多，疏水氨基酸含量增大，這與上述ACE抑制率的變化趨勢一致。Jia Junqiang等[23]研究表明超聲預(yù)處理可以改變蛋白的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)使蛋白結(jié)構(gòu)變的松散，使其更容易酶解，從而暴露更多的疏水性基團(tuán)，從而使疏水氨基酸比例增加。張莉莉等[24]研究表明酶解可以使疏水氨基酸組成的肽鍵斷裂，斷裂的同時又會有疏水性氨基酸處于新肽鏈的端基，這類處于端基的疏水性氨基酸表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水特性，更容易插入油脂表面，使親水的抗氧化氨基酸殘基也和脂質(zhì)靠近，發(fā)揮抗氧化效果。由表1可以看出，超聲預(yù)處理后的蓮子酶解物中疏水性氨基酸含量顯著提高，同時如圖1所示，這些酶解物具有較高的ACE抑制率；因此，推測蓮子蛋白酶解物中ACE抑制活性與構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)量及氨基酸排列有關(guān)[25]。

2.4 熒光光譜分析

圖3 不同模式超聲預(yù)處理下蓮子蛋白酶解物的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectroscopic analysis of lotus seed protein hydrolysates obtained by ultrasound pretreatment with different working modes

熒光光譜是通過測試蛋白質(zhì)微環(huán)境體系，來有效反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[26]。在蛋白質(zhì)氨基酸中，Try、色氨酸（Trp）和Phe殘基具有熒光特性，特別是Trp殘基對微觀環(huán)境的變化很敏感[27]。因此，Trp熒光可用來于鑒定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)變化，圖3A中蛋白質(zhì)的熒光峰為色氨酸殘基的熒光峰[28]。由圖3B可知，與對照組相比，超聲預(yù)處理提高了蓮子蛋白的熒光強(qiáng)度，且三頻超聲預(yù)處理下蓮子蛋白具有最大的熒光強(qiáng)度（998）。這種現(xiàn)象表明超聲波預(yù)處理可以誘導(dǎo)展開蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，致使后期的酶解處理更容易使蛋白球形結(jié)構(gòu)變得松散伸展，深埋在球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的色氨酸殘基暴露導(dǎo)致[29]，從而增加蓮子蛋白的熒光強(qiáng)度。另外發(fā)現(xiàn)λmax均大于330 nm，說明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[30]，且隨著超聲頻率組合的增多，蓮子蛋白λmax發(fā)生了輕微的紅移現(xiàn)象，這很有可能是蛋白質(zhì)在超聲作用下構(gòu)象發(fā)生改變，Trp側(cè)鏈轉(zhuǎn)移到蛋白分子表面造成蛋白微環(huán)境極性的增加，從而使熒光轉(zhuǎn)向更長的波長（紅移）[31]。

3 結(jié) 論

利用單頻、雙頻、三頻不同模式、不同頻率超聲預(yù)處理蓮子蛋白，得出了不同模式下的最優(yōu)頻率參數(shù)，在頻率20～60 kHz的范圍內(nèi)，對于蓮子蛋白而言，最優(yōu)頻率是20 kHz或其組合，這可能是由于每種蛋白都有使蛋白內(nèi)部的分子鏈展開的頻率，即敏感頻率或組合，20 kHz是蓮子蛋白的敏感頻率；不同模式最優(yōu)頻率的超聲預(yù)處理下，表面疏水性結(jié)果表明，隨著超聲頻率組合的增多，表面疏水性越來越大，疏水性氨基酸含量增多；且表面疏水性與疏水性氨基酸含量變化規(guī)律與ACE抑制率一致，說明ACE抑制活性與疏水性基團(tuán)及構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)量及氨基酸排列有關(guān)；通過熒光光譜發(fā)現(xiàn)，超聲預(yù)處理提高了蓮子蛋白的熒光強(qiáng)度，且熒光強(qiáng)度順序為三頻率＞雙頻率＞單頻率；同時，由于超聲作用下蓮子蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，Trp側(cè)鏈轉(zhuǎn)移到蛋白分子表面，造成蛋白微環(huán)境極性的增加，導(dǎo)致蓮子蛋白λmax發(fā)生輕微的紅移現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理雖然對水解度沒有明顯影響，但不同模式下的超聲預(yù)處理對ACE抑制率效果比較明顯，說明不同模式的超聲預(yù)處理對于蓮子蛋白酶解及ACE抑制肽的制備至關(guān)重要，該結(jié)論可為蓮子蛋白酶解、ACE抑制肽及營養(yǎng)價值更高和功能性質(zhì)更好的蛋白多肽等產(chǎn)品的制備提供理論支持。