■曲蕙名 王 瑩 楚 杰* 劉邦剛 王振國 劉建龍 劉可春

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南250014；2.山東省科學(xué)院生物研究所山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南250014；3.濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南250014）

自由基在自然界中是客觀存在的，適量的自由基有助于維持動物體內(nèi)正常的生命活動，動物體可依靠內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)多余的自由基，使自由基處于穩(wěn)衡性動態(tài)，動物機體處于穩(wěn)定的還原態(tài)[1]。但當(dāng)內(nèi)源性清除系統(tǒng)不能及時徹底的清除多余自由基時，過量的自由基誘發(fā)動物機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞膜，使血清抗蛋白酶失去活性，誘發(fā)一系列疾病[2]。魚類在養(yǎng)殖過程中易受到飼料組成、水體質(zhì)量等因素的影響而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而所有較為強烈的應(yīng)激都會伴隨著氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激對魚類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，影響魚體正常生長，誘發(fā)疾病甚至死亡，因此利用天然的抗氧化飼料添加劑十分必要。

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素，是維生素A的前體物質(zhì)，因其多烯烴結(jié)構(gòu)而有較好的抗氧化能力，能清除自由基，降低脂質(zhì)氧化物的產(chǎn)生，使機體的抗氧化狀態(tài)明顯改善[3]。β-胡蘿卜素具有抗氧化、提高免疫力和繁殖力等功效，是良好的飼料添加劑和營養(yǎng)增補劑。有研究報道，通過在飼料中添加不同水平的β-胡蘿卜素，可改善禽蛋質(zhì)量，提高生產(chǎn)性能和后代成活率[4-6]。目前β-胡蘿卜素作為抗氧化劑在魚類中的研究相對較少。斑馬魚作為一種新型模式脊椎動物，具有繁殖能力強、生殖周期短，胚胎透明、能在顯微鏡下進(jìn)行實時觀察等特點。斑馬魚被美國FDA列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究[7-9]。本文以轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚為實驗對象，研究了β-胡蘿卜素體外抗氧化活性及對轉(zhuǎn)基因斑馬魚抗氧化功能的影響，為魚類養(yǎng)殖過程中避免氧化應(yīng)激損傷和疫病預(yù)防提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素，實驗室由三孢布拉霉菌發(fā)酵后分離提取獲得（純度90%以上）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；VC、無水乙醇、30%H2O2、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、二甲亞砜(DMSO)等均為國產(chǎn)分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為實驗室自制雙蒸水；轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚CY-17（krt4:NTR-hKitGR）的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield[10]的方法。

1.2 實驗儀器

UV-2100型紫外可見分光光度計(上海合利儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海賀德實驗設(shè)備有限公司)；體式熒光顯微鏡SZX-16(日本Olympus公司)；311型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 β-胡蘿卜素體外抗氧化活性實驗

采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧法分別表征清除DPPH自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(·)的能力；測定β-胡蘿卜素的還原力，同時以VC做陽性對照。

1.3.1.1 DPPH·的清除實驗

將β-胡蘿卜素樣品分別配制成質(zhì)量濃度為20、40、60、80 μg/ml和100 μg/ml的待測樣液，具體操作參照MüLler等[11]方法略作調(diào)整：準(zhǔn)確稱取DPPH 0.019 7 g，用無水乙醇溶解并定容至50.00 ml作儲備液。將DPPH儲備液配制成100 μmol/l的工作液，取1.0 ml待測樣液與3.0 ml DPPH工作液充分混勻，于室溫反應(yīng)20 min，517 nm處測吸光度，VC組相同處理。清除率計算公式如下：

式中：A——DPPH·清除率(%)；

Ai——加入β-胡蘿卜素時溶液的吸光度；

Aj——β-胡蘿卜素溶液在測定波長處的吸光度;

A0——未加β-胡蘿卜素時溶液的吸光度。

1.3.1.2 羥基自由基的清除實驗

實驗前配制質(zhì)量濃度 20、40、60、80 μg/ml和100 μg/ml的β-胡蘿卜素樣液，具體操作參照李全國等[12]方法略作調(diào)整：配制9.0 mmol/l的FeSO4溶液；9.0 mmol/l的水楊酸溶液，無水乙醇配制；30%的市售H2O2稀釋為8.8 mmol/l。在反應(yīng)體系中依次加入2.0 ml FeSO4溶液，2.0 ml水楊酸-乙醇溶液，2.0 ml受試樣液，2.0 ml H2O2，充分混勻后在37℃下反應(yīng)30 min，在510 nm處測吸光值，VC組相同處理。清除率計算公式如下：

式中：B——·OH清除率(%)；

Bi——加入β-胡蘿卜素時溶液的吸光度；

Bj——β-胡蘿卜素溶液在測定波長處的吸光度;

B0——未加β-胡蘿卜素時溶液的吸光度。

1.3.1.3 超氧陰離子自由基的清除實驗

實驗前配制質(zhì)量濃度 20、40、60、80 μg/ml和100 μg/ml的β-胡蘿卜素樣液，具體操作參照許申鴻等[13]方法略作調(diào)整：配制pH為8.2、濃度為0.05 mol/l的Tris-HCl緩沖液，25 ℃預(yù)熱20 min；以10 mmol/l的HCl配制濃度為2.5 mmol/l的鄰苯三酚，25℃預(yù)熱20 min。在反應(yīng)體系中依次加入4.5 ml Tris-HCl緩沖液、1.0 ml受試樣液、0.5 ml鄰苯三酚溶液，充分混勻后 25 ℃反應(yīng) 5 min，立即加入8.0 mol/l的HCl（2～3滴）終止反應(yīng)，在320 nm處測吸光值，VC組相同處理。清除率計算公式如下：

Ci——加入β-胡蘿卜素時溶液的吸光度；

Cj——β-胡蘿卜素溶液在測定波長處的吸光度;

C0——未加β-胡蘿卜素時溶液的吸光度。

1.3.1.4 還原力的測定

實驗前配制濃度為120、140、160、180、200 μg/ml的β-胡蘿卜素溶液；配制0.2 mol/l pH值6.6的磷酸緩沖液、1%的鐵氰化鉀溶液、10%的三氯乙酸溶液、0.1%的氯化鐵溶液。具體操作參照王春霞等[14]方法并略作調(diào)整：取不同濃度的β-胡蘿卜素樣品溶液2.5 ml，依次加入2.5 ml磷酸緩沖液和2.5 ml鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min后，向反應(yīng)體系中加入2.5 ml三氯乙酸溶液，充分混勻后以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液5 ml，加入0.5 ml氯化鐵溶液和4 ml蒸餾水，混勻后室溫放置10 min于700 nm處測定吸光度。同時以VC做對照。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性實驗

1.3.2.1 實驗動物

胚胎發(fā)育的初期，魚類的皮膚只有兩層：最外面的包膜層和內(nèi)表皮基底層，這些就構(gòu)成了針對病原體入侵的第一道防御線。當(dāng)皮膚暴露于不利的外界環(huán)境中時，會觸發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，以防止其層中致癌突變的積累，藥物加入后能夠激活修復(fù)途徑，以恢復(fù)皮膚完整性[15]。

自由基可直接破壞糖類和磷脂等細(xì)胞膜組成結(jié)構(gòu)，引起氧化應(yīng)激，造成代謝障礙；改變線粒體膜滲透性，使大量細(xì)胞色素C被釋放，造成蛋白水解，DNA降解[16-18]。抗氧化藥物的加入可以淬滅細(xì)胞內(nèi)多余的自由基，從而減少細(xì)胞凋亡。

轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚是將表皮細(xì)胞特異性標(biāo)記綠色熒光蛋白與硝基還原酶（NTR）共同表達(dá)在斑馬魚表皮細(xì)胞上，在體式熒光顯微鏡下皮膚會顯示很多斑點。本研究對1dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）的轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚胚胎給藥脫膜，然后加入甲硝唑使得角質(zhì)細(xì)胞凋亡，熒光斑點減少；抗氧化藥物加入后，一部分角質(zhì)細(xì)胞的熒光得以表達(dá)，通過計數(shù)熒光點數(shù)即可測定藥物的抗氧化能力。

實驗前將健康成熟的轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚按雌雄比1∶1或1∶2比例放入交配缸中，中間放置隔板，次日清晨抽去隔板，光照刺激產(chǎn)卵后收集受精卵，消毒后放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h備用。

1.3.2.2 給藥處理

將恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h的轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚胚胎取出，1 mg/ml的鏈霉蛋白酶溶液進(jìn)行脫膜。將脫去卵膜的轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚胚胎隨機分成溶劑對照組、甲硝唑組、β-胡蘿卜素和VC組，β-胡蘿卜素和VC組設(shè)置4個實驗濃度(25、50、100、200 μg/ml)，加入24孔板中，每組2個副孔，每孔5個胚胎，實驗重復(fù)3次。

溶劑對照組加入5 μl的DMSO后，新鮮培養(yǎng)水補至2 ml；用DMSO將甲硝唑配制成4 mol/l的母液，使用時用新鮮培養(yǎng)水稀釋至濃度為0.01 mol/l，甲硝唑組加入2 ml 0.01mol/l的甲硝唑溶液；將β-胡蘿卜素用DMSO先配制成10、20、40、80 mg/ml的母液，每組分別加入5 μl不同濃度的母液后，用0.01 mol/l的甲硝唑溶液補至2 ml，配制成25、50、100、200 μg/ml 4個濃度的實驗組。VC組同樣處理。

1.3.2.3 統(tǒng)計分析

將給藥孵育24 h之后的孔板取出，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚的熒光點數(shù)，選擇卵黃囊延伸區(qū)部位進(jìn)行拍照。利用imagepro-plus軟件統(tǒng)計各組斑馬魚的熒光點數(shù)，運用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

相對抗氧化能力(%)=(給藥組皮膚熒光點數(shù)-甲硝唑組熒光點數(shù))/(溶劑對照組熒光點數(shù)-甲硝唑組熒光點數(shù))×100

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素清除自由基的能力

2.1.1 清除DPPH·的能力

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的以氮為中心順磁化合物，并具有孤對電子，其醇溶液呈紫色?？寡趸幬锏募尤肟墒笵PPH的孤對電子配對成電子對，而使其顏色變淺呈黃色，在最大光吸收波長處的吸光值下降，吸光度水平的降低表明抗氧化活性的增加[19]，因此可以用分光光度計進(jìn)行定量測定，以評價受試樣品的抗氧化能力。

圖1 不同濃度樣品對DPPH·的清除作用

由圖1可知，隨β-胡蘿卜素濃度的增大，其對DPPH·的清除率增大，樣品濃度從20 μg/ml到100 μg/ml，對 DPPH·的清除率從 56.32%增大到71.22%，清除能力均遵循劑量-效應(yīng)關(guān)系，有較好的清除能力。同等質(zhì)量濃度的VC清除率最大為92.75%，與VC相比，β-胡蘿卜素清除率小于VC，其抗氧化能力小于VC。

2.1.2 清除·OH的能力

羥基自由基（·OH）是生物體內(nèi)活性氧代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，是一種氧化性很強的自由基，能引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使機體發(fā)生氧化損傷[20]。Fe2+和過氧化氫混合后反應(yīng)產(chǎn)生·OH，水楊酸與·OH結(jié)合產(chǎn)生有色產(chǎn)物，在510 nm處有最大吸收。受試樣液的加入同樣會結(jié)合·OH，從而減少有色物的生成并降低吸光度。

圖2 不同濃度樣品對·OH的清除作用

由圖2可知，樣品濃度從20 μg/ml增大到100 μg/ml，β-胡蘿卜素對·OH的清除率從20.36%增大到29.81%，對·OH有一定的清除能力，同等濃度VC樣液的清除率從27.75%增大到41.12%，說明β-胡蘿卜素抗氧化能力小于VC，對·OH的清除能力較弱。

圖3 不同濃度樣品對O2-·的清除作用

2.2 還原力的測定

鐵氰化鉀還原法的原理為：K3Fe(CN)6+樣品→K4Fe(CN)6+樣品氧化物，K4Fe(CN)6+Fe3+→Fe4[Fe(CN)6]3，在波長700 nm條件下測定吸光度，吸光度越大，則樣品的還原力越大，抗氧化能力越強。

圖4 不同濃度樣品的還原力大小

如圖4所示，樣品濃度從120 μg/ml到200 μg/ml，β-胡蘿卜素組吸光度從0.50增大到0.74，VC組吸光度從0.86增大到1.18，還原力均隨濃度的增大而增大。與VC相比，β-胡蘿卜素有一定的還原能力，但還原能力相對較弱。

2.3 轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚抗氧化活性

1dpf后觀察到200 μg/ml實驗組中轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚畸形、死亡，其余實驗組結(jié)果如表1所示。由圖5可見，溶劑對照組中，轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚的皮膚熒光點數(shù)最多；甲硝唑組熒光點數(shù)最少。加入受試樣品后，重現(xiàn)觀察到熒光斑點，說明該樣品的抗氧化性有助于轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚恢復(fù)熒光斑點，正常生長。隨著受試樣品濃度的增加，熒光點數(shù)增多，抗氧化能力逐漸增強。低、中、高（25、50、100 μg/ml）三個實驗組，β-胡蘿卜素相對抗氧化能力分別為30.43%、53.62%和73.91%，同等濃度的VC抗氧化能力分別為44.92%、62.32%和78.26，說明在轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚體內(nèi)抗氧化實驗中，β-胡蘿卜素與VC相比，抗氧化能力相差不大。

表1 β-胡蘿卜素對轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚胚胎生成的影響

圖5 β-胡蘿卜素對轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚的抗氧化活性的影響

3 討論

本研究中β-胡蘿卜素體外抗氧化活性實驗的結(jié)果表明，β-胡蘿卜素對DPPH·、·OH和·有較好的清除作用，且隨著濃度的增大，清除率升高，清除能力均遵循劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)樣品濃度在20～100 μg/ml范圍內(nèi)時，最大清除率分別為71.22%、29.81%和65.28%，同等濃度下VC清除率分別為92.75%、41.12%和73.58%，β-胡蘿卜素抗氧化活性弱于VC。同時在還原力的測定實驗中，β-胡蘿卜素的還原力為0.74，與VC相比，β-胡蘿卜素具有一定的還原能力，但還原能力相對較弱。

根據(jù)以上體外抗氧化實驗結(jié)果，本研究以轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚為研究對象，進(jìn)行了β-胡蘿卜素的體內(nèi)抗氧化試驗，試驗中應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚CY-17（krt4:NTR-hKitGR），是將表皮細(xì)胞特異性標(biāo)記綠色熒光蛋白與硝基還原酶（NTR）共同表達(dá)在轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚表皮細(xì)胞上，形成一個條件性誘導(dǎo)的體系，在熒光顯微鏡下可觀察計數(shù)熒光細(xì)胞，當(dāng)加入甲硝唑時，與表皮細(xì)胞中的硝基還原酶結(jié)合，產(chǎn)生大量的自由基使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘發(fā)細(xì)胞毒作用，引起表皮細(xì)胞死亡，即綠色熒光點消失。再加入β-胡蘿卜素后，清除了多余的自由基，減少了細(xì)胞毒性，部分細(xì)胞恢復(fù)活性，使熒光點能夠重新在顯微鏡下觀察到。

試驗中采用了低、中、高三個實驗組，β-胡蘿卜素相對抗氧化能力分別為30.43%、53.62%和73.91%，同等濃度的VC抗氧化能力分別為44.92%、62.32%和78.26%；200 μg/ml實驗組中，轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚出現(xiàn)畸形和大量死亡，說明添加適量的β-胡蘿卜素有助于轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚的抗氧化損傷的修復(fù)，但過量添加可能會對動物體產(chǎn)生傷害甚至致死。原因可能是在動物體內(nèi)，氧化還原反應(yīng)是能量釋放和儲存的中心樞紐，許多細(xì)胞通路對氧化還原的環(huán)境非常敏感。適量添加抗氧化劑，有助于維持動物機體的氧化還原穩(wěn)態(tài)。但過量使用會導(dǎo)致氧剝奪和機體缺氧引起還原應(yīng)激，破壞細(xì)胞的能量供應(yīng)和還原當(dāng)量水平，影響細(xì)胞內(nèi)的其他氧化還原系統(tǒng)，導(dǎo)致信號傳導(dǎo)和基因激活的改變、線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。

目前，在飼料生產(chǎn)、運輸和貯存過程中常常會發(fā)生氧化變質(zhì)現(xiàn)象，降低了飼料品質(zhì)和營養(yǎng)價值，引起動物機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致種畜繁殖障礙，幼畜發(fā)病率高和成活率低、畜產(chǎn)品品質(zhì)下降?？寡趸暳咸砑觿┑倪m量使用可以有效保護機體內(nèi)的氧化平衡，減輕氧化應(yīng)激的危害，有效維持畜禽良好的生產(chǎn)性能和繁殖性能。尋求高效安全的抗氧化飼料添加劑，提高動物的抗氧化防御能力，β-胡蘿卜素作為常用的飼料添加劑，研究其抗氧化功能及作用機理對其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

綜上所述，適量添加β-胡蘿卜素可提高轉(zhuǎn)基因皮膚熒光斑馬魚抗氧化能力，可以作為天然有效的飼料添加劑應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖業(yè)。