■管軍軍 張?zhí)煊?高天增 王志祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧學(xué)博士后科研流動站，河南 鄭州 450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南 鄭州 450001）

仔豬由于其身體發(fā)育不完全的特征，導(dǎo)致其在不同階段對于飼料的要求不同的特性，鑒于此市面上已有專門針對仔豬的不同階段而設(shè)計的專用配合飼料。雖然這些仔豬專用飼料能夠解決一些消化問題，但是，還存在一些如消化不良、厭食等問題。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵飼料對于幼小動物的消化、吸收、食欲、腸道發(fā)育等方面有顯著提高[1-3]。

乳酸菌是定居在動物腸道中的正常微生物，常被選用菌種進行發(fā)酵飼料，具有潛在的益生作用，有利于維護動物的腸道健康。因其能夠代謝生成大量乳酸，降低飼料pH值，且飼料發(fā)酵后具有酸香味，從而能極大地提高動物的食欲。同時，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，能提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，降低抗營養(yǎng)因子含量，具有一定的抑菌作用，能夠防止雜菌污染，提高發(fā)酵飼料的品質(zhì)[4-5]。一般來說，乳酸菌發(fā)酵飼料常采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，既能降低成本，又能利用其厭氧發(fā)酵的特點進行深層發(fā)酵，利于大規(guī)模發(fā)酵的應(yīng)用。

但是，有關(guān)乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的研究鮮有報道。本課題組結(jié)合固態(tài)發(fā)酵飼料的產(chǎn)業(yè)化實際情況，在科學(xué)設(shè)計試驗方案的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料生產(chǎn)技術(shù)，本研究主要集中在發(fā)酵的工藝參數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)品主要營養(yǎng)指標（蛋白質(zhì)）的影響及工藝參數(shù)的優(yōu)化，為乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乳酸菌為河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，經(jīng)過篩選馴化后，并加以輔料經(jīng)冷凍干燥制成發(fā)酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存?zhèn)溆?。仔豬配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產(chǎn)，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)；JJ-CJ-1FD超凈工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠)；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；FA2004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 粗蛋白及其增加率的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432-1994對仔豬配合飼料或發(fā)酵產(chǎn)品進行粗蛋白的測定，以干基P表示。

蛋白增加率(%)=（P發(fā)酵后-P未發(fā)酵）/P未發(fā)酵×100

1.4 發(fā)酵試驗

將乳酸菌發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，30℃條件下靜置培養(yǎng)4 h。取發(fā)酵劑活化液一定比例（v/v）接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水組成，裝料100 g/瓶）上。攪拌均勻后，置于培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵，一定時間后取樣，50℃條件下干燥成品備用。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度及接種量的影響試驗

試驗主要研究不同的發(fā)酵時間（0、12、16、24、32、40、48 h），固態(tài)培養(yǎng)基組成[仔豬配合飼料∶水=（80∶20）、（70∶30）、（60∶40）、（50∶50）]，發(fā)酵溫度（25、28、30、32、35 ℃）及接種量（3%、5%、10%、15%、20%）對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響，其它因素還有培養(yǎng)基的種類（551H與552H），并進行7×2（發(fā)酵時間）、4×2（固態(tài)培養(yǎng)基組成）、5×2（發(fā)酵溫度）及5×2（接種量）試驗設(shè)計，每組試驗均重復(fù)3次。

1.5.2 優(yōu)化試驗設(shè)計——響應(yīng)面設(shè)計

在研究各種工藝參數(shù)影響的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際應(yīng)用及統(tǒng)計分析確定每個因素的最高與最低水平，進行4因素的響應(yīng)面設(shè)計，共27組，每組試驗均重復(fù)3次。試驗結(jié)果進行二次響應(yīng)面回歸建模，并預(yù)測最佳工藝參數(shù)。

1.5.3 驗證試驗

在優(yōu)化試驗確定最佳理論工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，并對該工藝參數(shù)進行相應(yīng)的發(fā)酵試驗，其結(jié)果與理論值進行比較，最終確定最佳工藝參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結(jié)果進行多因素方差分析（ANOVA）、最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較以及二次響應(yīng)面回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

本研究所選用的兩種仔豬配合飼料在配方上有所不同（見表1），551H側(cè)重于營養(yǎng)成分的強化與補充，且易于吸收消化，而552H側(cè)重于腸道健康并逐步向育肥豬飼料過渡，因此，前者更適用于斷奶仔豬，后者更適合年齡更大的仔豬，故兩種仔豬飼料具有代表性。本研究分別對兩種配合飼料進行乳酸菌固態(tài)發(fā)酵研究。通過發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品的影響可以發(fā)現(xiàn)(見圖1)，兩種配合飼料均隨著發(fā)酵時間的延長其蛋白含量及其增加率相應(yīng)提高，24 h之后，出現(xiàn)下降，趨勢基本一致；但是，發(fā)酵時間達到32 h后，兩種飼料的蛋白所受的影響不同，551H則繼續(xù)下降，40 h后才出現(xiàn)上漲的態(tài)勢，而552H則呈上升態(tài)勢。而通過統(tǒng)計學(xué)分析本次試驗結(jié)果，發(fā)酵時間顯著影響著乳酸菌對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1），各水平的多重比較排序為：0 hd、12 hc、16 hbc、24 hab、32 hb、40 hb、48 ha（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中發(fā)酵12 h后產(chǎn)品中蛋白含量及其增加率顯著高于未發(fā)酵的產(chǎn)品（P＜0.05），而且發(fā)酵24 h及48 h后對產(chǎn)品中蛋白的影響顯著高于發(fā)酵12 h的產(chǎn)品（P＜0.05），但是12～16、16～40 h及24～48 h各水平之間的差異并不顯著（P＞0.05），因此，結(jié)合試驗結(jié)果與應(yīng)用，在后續(xù)優(yōu)化試驗中對于551H，可確定發(fā)酵時間的最高水平為32 h及最低水平為12 h，而對于552H，可確定發(fā)酵時間的最高水平為48 h及最低水平為12 h。至于發(fā)酵原料影響，顯著影響產(chǎn)品蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P＜0.000 1），且發(fā)酵551H后蛋白的含量及其增加率明顯高于552H（P＜0.05）。

圖1 發(fā)酵時間對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

乳酸菌作為一種厭氧型微生物，由于固態(tài)發(fā)酵傳質(zhì)的不連續(xù)性，導(dǎo)致發(fā)酵微環(huán)境的變化呈現(xiàn)不一致性[6]，物料內(nèi)部由于其物理受力等原因，導(dǎo)致微環(huán)境中氧分較少，利于乳酸菌的生長。隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌的擴增，代謝產(chǎn)物的生成，改變了發(fā)酵的微環(huán)境條件，當微環(huán)境的養(yǎng)分不能滿足微生物的大量生長時，就會產(chǎn)生競爭性生長及微生物凋亡，代謝產(chǎn)物必然會被利用，產(chǎn)生過度發(fā)酵，導(dǎo)致有機氮流失，因此研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵24 h后蛋白含量在數(shù)值上出現(xiàn)下降的態(tài)勢。不過，對于這兩種飼料，這個下降態(tài)勢的持續(xù)時間并不一樣，551H持續(xù)較長，應(yīng)與其組成中大量可溶養(yǎng)分利于乳酸菌快速生長及產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物有關(guān)。若繼續(xù)發(fā)酵，隨著代謝產(chǎn)物的消耗，飼料中養(yǎng)分再次被利用，從而出現(xiàn)蛋白含量再次提升的態(tài)勢。而本研究中兩種飼料作為固態(tài)發(fā)酵基，乳酸菌可利用養(yǎng)分有所不同，551H優(yōu)于552H。

2.2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

本研究中固態(tài)培養(yǎng)基由仔豬配合飼料與水組成，如圖2所示，兩種培養(yǎng)基中，固液比的大小，影響著發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率，但結(jié)果二者不同。對于551H固態(tài)培養(yǎng)基，固液比的增加對于發(fā)酵的影響呈“N”形逐步向上態(tài)勢；而對于552H培養(yǎng)基，呈現(xiàn)出快速上升后趨緩態(tài)勢的特點。總的來說，固液比大于（70∶30）可獲得較高的產(chǎn)品品質(zhì)，而高固液比（80∶20）則不利于發(fā)酵的進行。本次研究中，固態(tài)培養(yǎng)基組成對于發(fā)酵的產(chǎn)品蛋白含量的影響（P=0.004 3＜0.01）及蛋白增加率（P＜0.000 1）有顯著影響，各水平的多重比較排序為：（80∶20）b、（70∶30）a、（60∶40）a、（50∶50）a（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，（80∶20）的影響明顯低于其它水平，但另外三個水平之間的差異并不顯著。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結(jié)合生產(chǎn)實際，確定固液比最高水平（80∶20=4）及最低水平（60∶40=1.5）。另外，培養(yǎng)基的種類對蛋白含量有顯著影響（P＜0.000 1），且發(fā)酵551H后蛋白的含量明顯高于552H（P＜0.05）。

圖2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

固態(tài)培養(yǎng)基中水分的含量影響著乳酸菌的生長與代謝。水分含量高，固態(tài)培養(yǎng)基中溶解于水中可利用的養(yǎng)分增多，利于微生物的生長，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量相應(yīng)得到提高。對于551H，配方組成中有大量營養(yǎng)成分且能易于溶解于水中，因此固態(tài)培養(yǎng)中水分含量（70∶30）的提高可溶解大量養(yǎng)分，利于乳酸菌的快速生長，再提高含水量，并不能提高這些養(yǎng)分的含量，因此，對發(fā)酵的影響不明顯。對于552H，其主要組成除玉米與豆粕外，其余營養(yǎng)組分較少，能夠被乳酸菌利用的主要是玉米與豆粕，其中的養(yǎng)分能被水溶解出，但過程緩慢，隨著固態(tài)培養(yǎng)基中水分含量的增加，其可溶養(yǎng)分漸漸提高，發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白指標也逐步提高。另一方面，培養(yǎng)基中水分含量高(低固液比)除了有利于營養(yǎng)組分的充分溶解外，固態(tài)培養(yǎng)基中顆粒間隙被水分子濕潤，封閉了發(fā)酵微環(huán)境，起到隔絕氧氣的作用，也利于乳酸菌厭氧發(fā)酵。

2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

圖3表現(xiàn)了兩種飼料在不同發(fā)酵溫度下其發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白的變化，而且對不同飼料，其變化趨勢不同。對于551H，溫度的影響基本呈“倒N”形態(tài)，25℃較有利于乳酸菌的生長，高于此溫度對菌種的生長有抑制作用；而對于552H，與之相反，基本呈“N”形態(tài)，30℃時發(fā)酵產(chǎn)品有較高的蛋白及其增長率，高于或低于此溫度，均不利于乳酸菌的生長。而對所獲得的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，溫度顯著影響著該發(fā)酵產(chǎn)品蛋白含量（P=0.041 1＜0.05）及其增加率（P=0.022 6＜0.05)，各水平的多重比較排序為：25 ℃abc、28 ℃ab、30 ℃a、32℃bc、35℃c（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，30～35 ℃之間差異比較顯著，25～30 ℃各水平間的差異并不顯著。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結(jié)合生產(chǎn)實際，確定最高發(fā)酵溫度30℃及最低發(fā)酵溫度25℃。至于發(fā)酵基的種類，在本次試驗中發(fā)現(xiàn)其對于產(chǎn)品蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P=0.004 1＜0.01）的影響顯著，具體表現(xiàn)在551H發(fā)酵后所得產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率明顯高于552H（P＜0.05）。

圖3 發(fā)酵溫度對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

乳酸菌的生長受溫度的影響，一般來說，30～40℃比較適合其生長。本研究中，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)及溫控成本，選擇低溫發(fā)酵，且在菌種的前期培養(yǎng)中選擇低溫馴化，這樣方便實際應(yīng)用，節(jié)省能源消耗。溫度的提高一方面促進了乳酸菌的生長，另一方面提高了可利用養(yǎng)分在水中的溶解度，便于乳酸菌快速利用，二者相互作用，此消彼長，共同決定著發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。由于選用的兩種飼料的組成不同，溫度對于發(fā)酵的影響不同。對于551H，由于可利用組分在所選溫度范圍內(nèi)溶解度影響不大，主要是對乳酸菌生長的影響，因此，隨著溫度的提高，乳酸菌生長迅速，養(yǎng)分充分利用而局部出現(xiàn)匱乏，限制了微生物的生長，從而影響了產(chǎn)品中蛋白含量。對于552H，可利用組分屬于大分子有機物，在水中的溶解度與溫度有關(guān)，提升溫度溶解度提高，乳酸菌生長速度加快，超過30℃后，其可利用組分溶解度變化不大，但微生物生長速度繼續(xù)增加，養(yǎng)分匱乏抑制乳酸菌生長，產(chǎn)品中蛋白含量出現(xiàn)下降態(tài)勢。

2.4 接種量對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

如圖4所示，接種量對于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵這兩種仔豬配合飼料的影響趨勢不一致。對于551H，接種量10%更利于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬飼料，過高或過低的接種量均不利于發(fā)酵的進行；而對于552H，3%的接種量所獲得的產(chǎn)品具有較高的蛋白含量及其增加率，而5%的接種量則具有較低的蛋白含量及其增加率。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，接種對發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量（P=0.004 0＜0.01）及其增加率（P=0.002 5＜0.01）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序為：3%a、5%b、10%a、15%a、20%a（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，5%接種量所得產(chǎn)品蛋白質(zhì)指標明顯低于其它水平。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結(jié)合生產(chǎn)實際，確定接種量最高水平為10%，最低水平為3%。另外，本次試驗中固態(tài)培養(yǎng)基對于產(chǎn)品中蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P=0.001 0＜0.01）影響顯著，具體是551H發(fā)酵后所得產(chǎn)品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但是552H發(fā)酵后蛋白增加率明顯高于551H（P＜0.05）。

本次試驗結(jié)果表明，接種量較高（10%～20%），乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量變化不大，較低的接種量（3%～5%）的情況下，兩種飼料表現(xiàn)出不同的結(jié)果。接種量的大小主要體現(xiàn)在菌種的起始分布密度上，隨著起始分布密度的提高，乳酸菌生長速度加快，當起始分布密度達到一定程度后，其對乳酸菌的生長促進作用開始減弱，因為可用養(yǎng)分限制了微生物的大量生長，所以當接種量超過10%后所得產(chǎn)品的蛋白指標變化不大。值得一提的是，對于552H，接種量3%時獲得了相當高的蛋白含量及其增加率，這應(yīng)與552H飼料中可利用組分主要為有機大分子以及微環(huán)境條件有關(guān)，當然，具體機制仍需要進一步研究。

圖4 接種量對乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.5.1 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～30 ℃，接種量3%～10%)下，進行如表2所示的響應(yīng)面試驗。通過對該試驗結(jié)果統(tǒng)計分析（表3）發(fā)現(xiàn)，在所構(gòu)造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項I×I、t×t、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項不顯著（P＞0.05），該模型可在各因素的水平范圍內(nèi)應(yīng)用于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H工藝。通過擬合并估計出二次響應(yīng)面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預(yù)測，其結(jié)果為：發(fā)酵時間27 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.125，發(fā)酵溫度25℃，接種量10%，此時有較高的蛋白含量（22.47%）及其增加率（7.23%）。

2.5.2 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～48 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～30 ℃，接種量3%～10%)下，進行如表4所示的響應(yīng)面試驗。通過對該試驗結(jié)果統(tǒng)計分析（見表5）發(fā)現(xiàn)，在所構(gòu)造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項I×I、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內(nèi)應(yīng)用于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H工藝。通過擬合并估計出二次響應(yīng)面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預(yù)測，其結(jié)果為：發(fā)酵時間48 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5，發(fā)酵溫度30℃，接種量3%，此時有較高的蛋白含量（20.87%）及其增加率（8.22%）。

2.5.3 驗證試驗

為了進一步檢驗經(jīng)過響應(yīng)面設(shè)計試驗所獲得的模型及其預(yù)測的最佳工藝條件的可靠性，在最佳工藝條件進行驗證試驗，并重復(fù)5次，結(jié)果及統(tǒng)計分析如表6所示：對于酵母固態(tài)發(fā)酵551H及552H，驗證試驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果差異性均不顯著（P＞0.05）,因此，模型預(yù)測的最佳工藝參數(shù)適合實際應(yīng)用。

3 結(jié)論

對于乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H及552H的發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值、發(fā)酵溫度、接種量等工藝參數(shù)進行了系統(tǒng)地研究，得到如下結(jié)論：

①在前期各因素對于固態(tài)發(fā)酵的影響試驗中，發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度、接種量以及固態(tài)培養(yǎng)基的種類顯著影響著乳酸菌對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率。

②對于固態(tài)發(fā)酵551H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～32 h、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4、發(fā)酵溫度25～30 ℃、接種量3%～10%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～48 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～30℃，接種量3%～10%。

表2 乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

表3 乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結(jié)果

表4 乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

表5 乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結(jié)果

表6 驗證試驗及統(tǒng)計分析結(jié)果

③通過響應(yīng)面試驗設(shè)計統(tǒng)計分析得到可靠性較高的二次響應(yīng)面回歸模型，并預(yù)測最佳工藝參數(shù)：對于固態(tài)發(fā)酵551H，發(fā)酵時間27 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.125，發(fā)酵溫度25℃，接種量10%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，發(fā)酵時間48 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5，發(fā)酵溫度30℃，接種量3%，驗證試驗證明該參數(shù)可行。

因此，該研究結(jié)果將為工業(yè)化乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的工藝提供試驗與理論支撐，但是仍需要進行放大試驗、中試等進一步研究，以便更好地應(yīng)用實際生產(chǎn)。