鄭世仲，江勝滔，劉偉，陳美霞，林玉玲，賴鐘雄*，林金科

1. 寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2. 閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100；3. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州350002；4. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 福州350002

茶樹的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate, EGCG）含量高于10%則可視為高EGCG茶樹種[1]。茶樹“1005”是由福建省高校農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育的高 EGCG茶樹新品系，屬于灌木型中葉種茶樹。EGCG為類黃酮化合物，是茶葉品質(zhì)的核心成分之一，也是茶多酚中最有效的活性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗輻射、抗糖尿病、抗高血脂等功效[2-5]。雖然有關(guān)類黃酮化合物生物合成的基本途徑已經(jīng)探明，相關(guān)產(chǎn)物的組分變化也有相關(guān)報(bào)道[6-7]，但 EGCG生物合成的分子機(jī)制仍然比較模糊，轉(zhuǎn)錄因子對(duì) EGCG生物合成的調(diào)控研究也相對(duì)較少。MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中[8-9]，在植物的次生代謝、器官形態(tài)構(gòu)建、細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂分化，甚至是環(huán)境脅迫應(yīng)答等都具有重要的調(diào)控作用[8,10-11]。

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控中心，位于基因5′上游側(cè)翼區(qū)域，能與RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的一段DNA序列，是基因的一個(gè)重要組成部分，也是真核生物基因表達(dá)調(diào)控不可缺少的的組成部分，包含了多個(gè)上游順式元件[12-15]。對(duì)啟動(dòng)子的深入研究，包括核心啟動(dòng)子序列的確定，調(diào)控元件的數(shù)量、類型及分布，將有助于我們更進(jìn)一步探究該基因的功能和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，也有利于研究外源相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。

本課題組經(jīng)過前期的實(shí)驗(yàn)研究，以高EGCG茶樹新品系“1005”及其父母本黃旦和福云七號(hào)為材料，利用高通量測(cè)序技術(shù)和相關(guān)軟件分析，篩選出了與茶樹 EGCG生物合成密切相關(guān)的一個(gè) MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為CsMYB，并對(duì)CsMYB基因的克隆及其表達(dá)特性進(jìn)行了深入的研究[16-17]，但對(duì)其發(fā)揮作用的信號(hào)途徑和上游調(diào)控因子還不清楚。

本次研究擬在課題組前期的研究基礎(chǔ)上，對(duì)CsMYB基因的5′側(cè)翼調(diào)控序列進(jìn)行分離克隆，對(duì)序列中含有的各類調(diào)控元件進(jìn)行分析，并通過轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行初步的驗(yàn)證，從而為進(jìn)一步闡明CsMYB基因的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、CsMYB基因在茶樹EGCG合成過程中的時(shí)空表達(dá)特性、調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為福建省高校農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育的茶樹“1005”新品系，采摘嫩芽后立即放入液氮中，并保存于-80℃的冰箱，用于茶樹總DNA的提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樹基因組DNA的提取與CsMYB基因gDNA擴(kuò)增

采用丁曉東等[18]改良的 CTAB法，提取茶樹總DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。根據(jù)已克隆并登錄NCBI的CsMYB基因 cDNA 核苷酸序列（KM079193.1）設(shè)計(jì)引物[17]，擴(kuò)增CsMYB基因的gDNA全長(zhǎng)序列。gDNA擴(kuò)增上下游引物（gF、gR）見表1。

1.2.2CsMYB基因5′側(cè)翼序列的擴(kuò)增

采用染色體步移技術(shù)[19]對(duì)茶樹CsMYB基因的 5′側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增。在CsMYB基因gDNA序列靠近5′端設(shè)計(jì)3條反向引物，進(jìn)行3輪巢式 PCR擴(kuò)增，PCR體系和程序參照Genome WalkingTMUniversal Kit（TAKARA）的試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。引物見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化、克隆與測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割并用 GeneJET Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）回收純化目的片段，連接于pMD18-T Simple Vector（TAKARA），然后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后挑選單克隆進(jìn)行 PCR檢測(cè)，選擇陽(yáng)性菌落送華大基因公司（深圳）測(cè)序。

1.2.4 啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

克隆測(cè)序后，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件將獲得序列結(jié)果與已知的序列進(jìn)行比對(duì)拼接和分析；在線軟件 Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 對(duì)分離得到序列的核心啟動(dòng)子區(qū)域及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；同時(shí)利用在線軟件 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html) 對(duì)啟動(dòng)子潛在順式作用元件進(jìn)行分析。

1.2.5茶樹CsMYB基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

首先，克隆帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和NcoⅠ的目的片段 BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ。通過DNAMAN 6.0軟件分析啟動(dòng)子序列的酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示CsMYB基因啟動(dòng)子序列不含有BamHⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，啟動(dòng)子序列5′端和 3′端分別設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和NcoⅠ的上下游引物Pro-F和Pro-R，同時(shí)在引物5′端添加相應(yīng)的保護(hù)堿基，設(shè)計(jì)的引物見表1。以啟動(dòng)子序列分析正確的步驟1.2.3將大腸桿菌菌液進(jìn)行擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，并以相應(yīng)質(zhì)粒為模板，利用高保真酶 KOD-Plus-Neo (code:KODo41)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化目的片段，克隆測(cè)序，序列比對(duì)正確后，產(chǎn)物命名為BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ。

表1 CsMYB基因gDNA克隆、啟動(dòng)子克隆和載體構(gòu)建引物Table 1 Primers for gDNA cloning, promoter cloning and vector construction

其次，構(gòu)建含BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ的重組表達(dá)載體。運(yùn)用 FastDigestBamHⅠ和FastDigestNcoⅠ限制性內(nèi)切酶（Thermo Scientific）分別雙酶切上述步驟的純化產(chǎn)物BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ和 pCAMBIAl301空載體，并分別回收純化酶切后的 BamHⅠ-proMYB-NcoⅠ和pCAMBIAl301的大片段。SolutionⅠ（TAKARA）連接純化的兩條片段，連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后選陽(yáng)性克隆搖菌提取重組質(zhì)粒。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切以及用表1的特異引物（Pro-F/Pro-R）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增雙重檢測(cè)。成功構(gòu)建的重組表達(dá)載體命名為 p1301-proMYB-GUS。

最后，利用凍融法[20]將 p1301-proMYBGUS重組質(zhì)粒和 pCAMBIA1301空載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105感受態(tài)細(xì)胞，YEB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)48 h后挑單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。

1.2.6重組質(zhì)粒p1301-proMYB-GUS農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)分析

參照Li等人[21]的方法，將步驟1.2.5驗(yàn)證后的陽(yáng)性 EHA105用一次性針筒注射進(jìn)入煙草（Nicotiana benthamiana）的葉脈中；25℃條件下光照/黑暗（14 h/10 h）培養(yǎng)3 d，用打孔器打孔取煙草葉片的菌液侵染部位，放入GUS染色液進(jìn)行組織化學(xué)染色[22]，觀察鑒定。以只攜帶 pCAMBIA l301空載體的 EHA105菌株侵染煙草作陽(yáng)性對(duì)照，不攜帶任何載體的EHA105菌株侵染煙草作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsMYB基因gDNA擴(kuò)增與結(jié)構(gòu)分析

在已知的CsMYB基因 cDNA序列的5′UTR和 3′UTR非編碼區(qū)，分別設(shè)計(jì)上下游引物，以茶樹總DNA為模板擴(kuò)增CsMYB基因的gDNA全長(zhǎng)序列，將克隆測(cè)序后的序列與相應(yīng)的cDNA序列通過DNAMAN 6.0進(jìn)行比對(duì)分析驗(yàn)證，最后得到CsMYB基因gDNA序列全長(zhǎng)（從起始密碼子到終止密碼子）為1 828 bp。利用在線軟件 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)[23]和DNAMAN6.0對(duì)基因組序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖1，CsMYB基因組gDNA由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，兩個(gè)內(nèi)含子分別位于308～1 030和1 228～1 480，長(zhǎng)度分別為 723 bp和 253 bp，AT量分別為67.1%和 70.7%，兩個(gè)內(nèi)含子的 5′端剪接供體分別為 AGG/GTATGA和 ATG/GTATTA，3′端剪接受體分別為 TAG/GA和 CAG/GT，兩個(gè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度均大于真核生物基因內(nèi)含子最小長(zhǎng)度 70 bp，且內(nèi)含子剪切位點(diǎn)都符合真核生物經(jīng)典的GT/AG規(guī)則[24]。

圖1 CsMYB基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of CsMYB gDNA

圖2 CsMYB基因啟動(dòng)子電泳圖Fig. 2 The electrophoretogram of the promoter of CsMYB

2.2 茶樹CsMYB基因啟動(dòng)子的克隆

通過3輪的巢式PCR擴(kuò)增，并通過單引物PCR驗(yàn)證，最后確定在1 100 bp左右的電泳條帶可能為CsMYB基因的目的條帶（圖2）?；厥占兓涂寺y(cè)序，目的條帶實(shí)際長(zhǎng)度為1 038 bp。

序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增得到序列的 3′端與CsMYB基因gDNA序列5′端58 bp完全一致，同時(shí)與CsMYB基因的 cDNA序列的5′UTR末端108 bp也重疊吻合，結(jié)合NCBI-Blast分析表明，克隆得到的 1 038 bp序列為CsMYB基因上游5′端側(cè)翼調(diào)控序列，命名為proMYB，結(jié)果見圖3。proMYB序列與 gDNA序列一起登錄 GenBank，登錄號(hào)為KU133350.1。

2.3 茶樹CsMYB基因啟動(dòng)子序列分析

Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)分析表明，該啟動(dòng)子序列存在預(yù)測(cè)峰值分別為0.91、0.99和0.51的3段核心啟動(dòng)子區(qū)域，分別位于 387～437、432～482 和 883～933，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為 A、C、A，分別位于第 427、472、923。在線軟件 PlantCare對(duì) ATG上游的調(diào)控序列進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4，該啟動(dòng)子序列除了含有與提高基因轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的5′UTR Py-rich stretch順式作用元件，啟動(dòng)子核心元件TATA-box和CAAT-box之外，同時(shí)還存在有赤霉素應(yīng)答元件 P-box和TATC-box，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，光響應(yīng)元件Box 4、Box II和GT1-motif，厭氧脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)元件 ARE，冷害和脫水響應(yīng)元件C-repeat/DRE，熱激脅迫響應(yīng)元件HSE；此外，該序列還含有大量功能未知或者功能特異的順式作用元件。

2.4 茶樹CsMYB基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和 PCR雙重驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。雙酶切得到的短片段以及用特異性引物擴(kuò)增得到的目的條帶，均與啟動(dòng)子片段大小一致，說明啟動(dòng)子表達(dá)載體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為p1301-proMYB-GUS載體。

將 p1301-proMYB-GUS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)，用特異性引物進(jìn)行 PCR檢測(cè)，產(chǎn)物片段與啟動(dòng)子片段大小一致，說明 p1301-proMYB-GUS成功導(dǎo)入EHA105農(nóng)桿菌，可以繼續(xù)后續(xù)的試驗(yàn)研究。

圖3 茶樹CsMYB基因5′端側(cè)翼序列Fig. 3 The 5′-flanking sequence of CsMYB

圖4 CsMYB 5′側(cè)翼序列順式元件預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of cis-acting elements of 5′-flanking sequence of CsMYB

圖5 p1301-proMYB-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig. 5 Construction and verification of the expression vector of p1301-proMYB-GUS

2.5重組質(zhì)粒p1301-proMYB-GUS轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)分析

煙草葉片的GUS組織化學(xué)染色的結(jié)果見圖6。陽(yáng)性對(duì)照和 p1301-proMYB-GUS煙草葉片均有肉眼明顯可見的藍(lán)色，陰性對(duì)照未見藍(lán)色。說明 proMYB啟動(dòng)子片段具有啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)功能，可以驅(qū)動(dòng)下游GUS基因的表達(dá)。

圖6 煙草葉片的GUS染色分析Fig. 6 Analysis of GUS histochemical staining of tobacco leaves

3 討論

啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性影響著基因表達(dá)的時(shí)空順序和基因表達(dá)水平[25]。因此，對(duì)基因啟動(dòng)子進(jìn)行分離克隆和分析研究，可以闡述相應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制和表達(dá)模式。本研究利用染色體歩移技術(shù)（Genome Walking）從茶樹 DNA 中分離得到CsMYB的 5′側(cè)翼序列proMYB（1 038 bp）轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果表明，proMYB具有啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)功能，能夠驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)。不同的啟動(dòng)子使基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，根據(jù)作用的方式差別，高等植物啟動(dòng)子通?？煞譃檎T導(dǎo)型、組成型及組織特異性 3種類型的啟動(dòng)子[26]，序列分析表明，該序列含有相關(guān)激素應(yīng)答和脅迫應(yīng)答的順式調(diào)控元件，初步推斷proMYB啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

許多研究表明，ABA、SA、MeJA和GA3等多種外源激素可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，它們?cè)谥参锏募?xì)胞分裂與生長(zhǎng)、病原菌防御、組織器官分化、次生代謝物質(zhì)的合成與積累等方面具有重要作用[27-29]。Mundy等[30]研究表明，外源激素可以作為反式作用因子與啟動(dòng)子的相應(yīng)調(diào)控元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)控該基因表達(dá)；相關(guān)研究也表明，GA3、MeJA、ABA和SA等植物激素對(duì)植物適應(yīng)外界的環(huán)境脅迫具有一定的調(diào)控作用[31-34]。但是，順式元件分析表明，我們分離得到的 proMYB序列卻沒有發(fā)現(xiàn)MeJA和 ABA順式作用元件，這可能有兩種解釋：一是CsMYB5′端1 038 bp側(cè)翼序列只是相應(yīng)基因啟動(dòng)子的一部分，proMYB沒有包含MeJA和ABA順式作用元件；二是由于軟件預(yù)測(cè)的局限性，proMYB序列存在未被發(fā)現(xiàn)的順式作用元件。此外，proMYB序列含有多個(gè)功能未知的順式元件，這些功能未知元件可能對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控起一定的作用，但是這些元件作用的機(jī)制均有待進(jìn)一步的研究。

順式元件分析表明，proMYB含有對(duì)光、厭氧脅迫、冷害、熱激脅迫和水分變化的響應(yīng)元件，說明環(huán)境變化可以誘導(dǎo)茶樹CsMYB基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化，目前，MYB作為植物最大的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物抗逆方面的調(diào)控作用已經(jīng)被許多研究證實(shí)[35-37]。

植物對(duì)外界因素脅迫的耐受性大多受到多個(gè)基因控制，一個(gè)功能強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控多個(gè)功能基因表達(dá)，大多數(shù)植物轉(zhuǎn)錄因子參與脅迫應(yīng)答的途徑主要有依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和不依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種途徑[38-39]，此外，轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用可能還受到其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。本研究主要對(duì)CsMYB基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和功能分析，在啟動(dòng)子水平上初步鑒定了CsMYB基因功能，為進(jìn)一步研究該基因在 EGCG生物合成過程的具體調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。