陳江飛，余津銘，楊建坤，余有本，肖斌，楊亞軍,2，王偉東*

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]是我國重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，其生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受各種環(huán)境脅迫，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。因此，研究茶樹的抗逆機(jī)制，鑒定抗性基因，對(duì)通過分子育種技術(shù)培育抗性茶樹優(yōu)良品種具有重要意義。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+/H+antiporter，NHX）是一種高度保守的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，根據(jù)其在細(xì)胞中定位不同分為兩大類，一類位于質(zhì)膜上（Plasma membrane，PM），另一類位于細(xì)胞內(nèi)部（Intra-cellular，IC），其中 IC類成員進(jìn)一步分為定位于液泡膜上的Class I和定位于內(nèi)囊體膜上的Class II[2-3]。大量研究證實(shí)，NHX參與了對(duì)植物生長發(fā)育，如下胚軸生長、葉片發(fā)育、花粉生長、花色形成的調(diào)控[4-7]，且在鹽脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[8]。鹽脅迫下，NHX依賴H+-ATPase和H+-PPase所形成的H+電化學(xué)梯度將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+/K+排出體外或區(qū)域化到液泡中，從而避免或降低鹽脅迫對(duì)植物體的傷害[9]，如 Quintero等[10]研究顯示，AtNHX1能夠恢復(fù)酵母突變體nhxl對(duì)Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力從而增加了其對(duì)NaCl的抗性，而過表達(dá)OsNHX1亦能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Na+的耐受性[11]。此外，越來越多的研究證實(shí)NHX也參與了植物對(duì)干旱、極端溫度以及ABA等脅迫的響應(yīng)過程，如Yokoi等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNHX1和AtNHX2的表達(dá)水平受ABA誘導(dǎo)，Venema等[13]亦發(fā)現(xiàn)ABA能夠誘導(dǎo)番茄LeNHX2上調(diào)表達(dá)；柑橘NHX受到短暫高溫脅迫后能夠提高其 mRNA轉(zhuǎn)錄水平[14]；同樣，5% PEG 6000模擬干旱處理能夠顯著誘導(dǎo)大豆GmNHX1的表達(dá)[15]。上述研究結(jié)果表明，NHX在植物脅迫應(yīng)答中具有廣泛功能，其在植物抗逆生理中具有廣闊的研究前景及應(yīng)用價(jià)值。目前，在擬南芥[10]、棉花[16]、玉米[17]、小麥[18]中已成功克隆出多個(gè)NHX基因，然而茶樹NHX目前仍未被克隆，其在茶樹脅迫響應(yīng)中的功能尚不清楚。

本研究以龍井長葉品種茶樹為材料，克隆獲得了CsNHX1和CsNHX2基因 cDNA全長序列，利用生物信息學(xué)手段初步分析了2個(gè)基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）分析了CsNHX1和CsNHX2在多種非生物脅迫下的表達(dá)模式，以探討其在逆境脅迫下的生物學(xué)功能，為茶樹抗逆分子遺傳育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

選取長勢良好、一致的2年生龍井長葉品種茶樹扦插穴盤苗于人工氣候箱中預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：晝夜溫度24℃/22℃，光周期12 h/12 h，光照強(qiáng)度240 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度70%～80%。2周后將茶苗隨機(jī)分組進(jìn)行不同的脅迫處理：將茶苗分別置于控溫為40℃或4℃的人工氣候箱進(jìn)行高溫和低溫脅迫處理；將茶苗連同穴盤一起置于含有 200 mmol·L-1NaCl或20% PEG 6000的溶液中，使根系完全浸泡在溶液中進(jìn)行高鹽脅迫和干旱脅迫處理；用100 μmol.L-1外源 ABA 噴施茶苗葉片進(jìn)行ABA誘導(dǎo)處理；保持原培養(yǎng)條件不變，未做任何處理的茶苗作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。于處理后 0、1、2、4、8、12、24、48 h取芽下第一、二葉各 0.1 g，液氮速凍后存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

采用CTAB法提取葉片材料總RNA[19]，用 NanoDrop 2000c（Thermo Scientific，美國）檢測RNA濃度與質(zhì)量，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（ABM，加拿大）反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA第一鏈，用于基因克隆與熒光定量PCR分析。

1.3 茶樹CsNHX1、CsNHX2基因的克隆

從龍井長葉品種茶樹轉(zhuǎn)錄組（NCBI SRA數(shù)據(jù)庫：SRP128078）中檢索獲得CsNHX1和CsNHX2序列信息[20]，利用 IDT（http：//sg.idtdna.com/calc/analyzer)在線軟件設(shè)計(jì)各自特異性引物（表1），以龍井長葉品種茶樹葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×Taq Master Mix 25 μL，模板 5 μL，上下游引物各 2.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至 50 μL。程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后用 Gel Extraction Kit（OMEGA，美國）試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接至 pMD19-T載體（TaKaRa，大連），轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞（唯贊生物，南京）后送楊凌奧科生物科技有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的Blast工具對(duì)獲得的基因及其編碼蛋白進(jìn)行同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析；ProtParam tool預(yù)測氨基酸的組成與理化性質(zhì)；DNAMAN 6.0與MEGA 7.0進(jìn)行多序列比對(duì)并用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）進(jìn)行氨基酸親/疏水性分析；Netphos 3.0 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線網(wǎng)址預(yù)測信號(hào)肽；TMHMM Server 2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in the study

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據(jù)克隆得到的基因序列設(shè)計(jì)定量引物（表1），以茶樹CsPTB基因?yàn)閮?nèi)參基因[21]，按 SYBR? Premix Ex Taq II（TaKaRa，大連）使用說明進(jìn)行 qRT-PCR分析。使用 IQ5 Multi-Color Real time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，95℃3 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min 30 s，循環(huán) 40次；60℃ 30 s，71個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)上升0.5℃。每個(gè)樣品均設(shè) 3次技術(shù)重復(fù)，采用算法分析結(jié)果[22]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 22軟件統(tǒng)計(jì)分析，以Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsNHX1、CsNHX2基因克隆與序列分析

以龍井長葉品種茶樹葉片的 cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過 1%瓊脂糖凝膠電泳獲得 2條單一條帶（圖1），測序結(jié)果顯示序列分別長 1 691 bp和1 757 bp，均包含1個(gè)1 626 bp的開放閱讀框，編碼 541個(gè)氨基酸，與轉(zhuǎn)錄組檢索序列一致，為CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全長序列，序列已經(jīng)上傳至GeneBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為：MG722977和MG515211。編碼蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，CsNHX1和 CsNHX2蛋白序列與其他植物NHX蛋白具有較高同源性，均包含1個(gè)保守的Na+/H+Exchanger結(jié)構(gòu)域和 1個(gè)糖基化位點(diǎn)，且在保守結(jié)構(gòu)域上游均包含1個(gè)NHX蛋白抑制劑：氨氯吡嗪脒的結(jié)合位點(diǎn)（LFFIYLLPPI）（圖2）。

圖1 CsNHX1和CsNHX2基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig. 1 RT-PCR amplification of CsNHX1 and CsNHX2 genes

圖2 茶樹和其他植物NHX的多重序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of NHXs from Camellia sinensis and other plants

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 23個(gè)不同植物的 NHX構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示 CsNHX1與可可TcNHX1及葡萄 VvNHX1親緣關(guān)系較近，CsNHX2則與可可TcNHX2及煙草NtNHX2親緣關(guān)系較近，均屬于 IC類的 Class I成員，即液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；而均與質(zhì)膜型 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PM）如擬南芥 AtNHX8、葡萄VvNHX7等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

2.3 CsNHX1、CsNHX2蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，CsNHX1和CsNHX2的分子式分別為 C2752H4285N671O759S17和C2749H4303N687O739S29，分子量為59.5 kD和59.7 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為 7.07和 8.79，分別含有負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）39個(gè)和 31個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）39個(gè)和 36個(gè)，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定系數(shù)為34.48和40.63，推測CsNHX1為穩(wěn)定的堿性蛋白，而CsNHX2為不穩(wěn)定的堿性蛋白。

2.3.2 磷酸化位點(diǎn)與親/疏水性分析

磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果如圖4-A、4-B所示，CsNHX1和CsNHX2均包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，且多個(gè)位點(diǎn)的預(yù)測值在0.90以上，推測2個(gè)蛋白很有可能受到磷酸化作用的調(diào)控。另外，親/疏水預(yù)測結(jié)果顯示CsNHX1、CsNHX2的疏水區(qū)域均大于親水性區(qū)域，GRAVY值分別為0.586和0.574，表明其均屬于疏水性蛋白（圖4-C、4-D）。

圖3 不同物種的NHX蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of NHX protein sequences from different species

2.3.3 跨膜結(jié)構(gòu)域分析

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（圖5），CsNHX1和 CsNHX2均屬于典型的跨膜蛋白，分別具有11、10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，SignalP預(yù)測結(jié)果顯示CsNHX1和CsNHX2的D值分別為0.357和 0.193（小于 cut off值 0.5），表明它們均沒有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。

圖4 CsNHX1和CsNHX2磷酸化位點(diǎn)與疏水性分析Fig. 4 Phosphorylation site prediction and hydrophobicity analysis of CsNHX1 and CsNHX2

圖5 CsNHX1和CsNHX2跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig. 5 Transmembrane domains analysis of CsNHX1 and CsNHX2

2.3.4 非生物脅迫下的表達(dá)分析

熒光定量分析結(jié)果如圖6和圖7所示，20% PEG 6000、低溫和 NaCl處理下茶樹CsNHX1和CsNHX2基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)水平整體呈現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)模式。不同的是，低溫處理下CsNHX2表達(dá)水平緩慢增加并維持在一定水平，而CsNHX1在迅速增加后于24 h開始明顯降低。高溫脅迫處理下，CsNHX1和CsNHX2基因表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，其中CsNHX1表達(dá)水平于4 h開始顯著降低并維持在較低水平，而CsNHX2表達(dá)水平顯著增加，在8 h達(dá)到的峰值后開始回落，但仍顯著高于對(duì)照。ABA處理下，CsNHX1在4 h和24 h分別出現(xiàn)了上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，CsNHX2的表達(dá)水平則在8 h和12 h出現(xiàn)降低，但整體變化趨勢均不顯著。

3 討論

圖6 CsNHX1在非生物脅迫下的表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis of CsNHX1 under abiotic stresses

圖7 CsNHX2在非生物脅迫下的表達(dá)分析Fig. 7 Expression analysis of CsNHX2 under abiotic stresses

NHX在植物的生長發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答過程中起著至關(guān)重要的作用，其生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制受到越來越多的關(guān)注[23]。本研究基于茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得了茶樹CsNHX1和CsNHX2基因，其編碼蛋白均含有 NHX蛋白典型的功能結(jié)構(gòu)域——Na+/H+Exchanger，且該結(jié)構(gòu)域上游均包含 1個(gè)氨氯吡嗪脒的結(jié)合位點(diǎn)：LFFIYLLPPI[24]。已有研究證實(shí)，氨氯吡嗪咪及其類似物是NHX蛋白的競爭性抑制劑[25]，如MIA[5-(N-甲基-N-異丁)-氨氯吡嗪咪]可顯著抑制水稻根 NHX 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[26]，故推測茶樹CsNHX1和CsNHX2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性可能也受到類似抑制作用。另外，跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示CsNHX1和CsNHX2分別含有11個(gè)和10個(gè)跨膜區(qū)，且分別含有1個(gè)和2個(gè)未完全跨膜區(qū)，未完全跨膜區(qū)域被認(rèn)為是與Na+結(jié)合的重要位點(diǎn)[27]，表明CsNHX1和CsNHX2在與Na+結(jié)合上存在一定的差異。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明茶樹 CsNHX1和CsNHX2均屬于IC類中的Class I分支成員，意味著其可能主要定位于液泡膜上發(fā)揮Na+/H+區(qū)域化功能。

眾多研究已證實(shí)植物NHX基因會(huì)被鹽脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，以提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[28]。本研究亦顯示鹽脅迫下CsNHX1和CsNHX2均被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表明其參與了茶樹對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過程，這與其他物種中相關(guān)研究結(jié)果高度一致[29-30]。最近，Brinin等[31]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能夠增加小麥TaNHX1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；蘋果MdNHX1同樣受到干旱脅迫的誘導(dǎo)[32]，這與本研究顯示PEG 6000處理顯著誘導(dǎo)了茶樹CsNHX1和CsNHX2基因的表達(dá)相一致，暗示CsNHX1和CsNHX2基因同樣參與了茶樹對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)?，F(xiàn)有研究表明，植物NHX基因在低溫脅迫下具有不同的應(yīng)答模式，如玉米ZmNHX1基因不能被低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[17]，而小果白刺N(yùn)sNHX1在低溫脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)[33]，本研究顯示茶樹CsNHX1和CsNHX2基因在低溫脅迫下亦被誘導(dǎo)表達(dá)，與小果白刺中研究結(jié)果一致。另外，茶樹CsNHX2在高溫處理后表達(dá)量顯著增加，這與Porat等[14]報(bào)道的高溫處理顯著提高柑橘NHX1表達(dá)水平的結(jié)果類似，但茶樹CsNHX1基因表達(dá)水平在高溫脅迫處理下顯著下調(diào)，推測CsNHX1和CsNHX2在茶樹響應(yīng)高溫脅迫過程中發(fā)揮不同的生物功能。ABA與植物抗逆性有著密切的聯(lián)系，是植物逆境響應(yīng)過程中最初的信號(hào)物質(zhì)，根據(jù)其是否參與分為依賴ABA途徑與不依賴 ABA途徑[34]。擬南芥AtNHX1、AtNHX2受到ABA的誘導(dǎo)，依賴ABA途徑參與對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[12]，棉花GhNHX1[16]、水稻OsNHX1和OsNHX2均與之類似[35]，而菊苣CiNHX1[36]及甜菜BvNHX1[37]不受 ABA誘導(dǎo)為不依賴 ABA途徑。本研究中，外源ABA處理下茶樹CsNHX1和CsNHX2表達(dá)水平變化趨勢不顯著，意味著其可能在茶樹逆境響應(yīng)過程中也是不依賴ABA途徑。

植物液泡膜 NHX的抗鹽機(jī)制已較為明確[38]，Na+經(jīng)長距離運(yùn)輸?shù)降厣喜糠趾?NHX利用跨膜 H+電化學(xué)梯度將其區(qū)域化到液泡中，使地上部分能夠積累較多的Na+，從而降低鹽脅迫對(duì)植物體的影響[39]。此外，大量研究表明，NHX可以通過維持細(xì)胞正常的滲透壓，從而緩解高溫、干旱等多種逆境脅迫的影響[40]。本研究中，茶樹CsNHX1和CsNHX2均受到高溫、干旱、低溫和鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，我們推測茶樹CsNHX1和CsNHX2亦可能通過區(qū)域化 Na+和維持細(xì)胞正常滲透壓提高茶樹對(duì)鹽脅迫和其他脅迫的耐受性，其功能機(jī)制將是我們今后深入研究的重點(diǎn)。