孔雷，朱向向，王屹瑋，謝小芳，江昌俊，李葉云

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥，230036

MicroRNAs（miRNAs）是內(nèi)源性單鏈非編碼小 RNA，在動物和植物中主要是在促進(jìn)靶向 mRNA的剪切或翻譯抑制中起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。miR164家族是植物中廣泛存在的一類保守microRNA，近年來，關(guān)于miR164家族成員參與植物抗逆脅迫的報(bào)道越來越多[2]。miR164的表達(dá)具有組織及發(fā)育階段特異性，在植物細(xì)胞生長、組織發(fā)育、器官形成中起著重要的調(diào)控作用[3-4]。在擬南芥中，miR164在根部和花中的表達(dá)量比在葉片中的高[5]。在擬南芥和煙草花器官、分生組織以及原形成層中有miR164表達(dá)，且表達(dá)量較高[6]。在逆境脅迫條件下，植物miR164響應(yīng)逆境脅迫，并且可能作為調(diào)控分子在防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[3]。在非生物脅迫條件下，機(jī)械損傷會抑制毛果楊miR164的表達(dá)[7]，鹽脅迫和干旱脅迫處理會抑制甜楊幼苗 miR164的表達(dá)[8]。

植物 miR164調(diào)控的靶基因?qū)儆谥参颪AC（NAM，ATAF1/2 和 CUC2）轉(zhuǎn)錄因子[3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是一個植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族[9-10]?？偟膩碚f，NAC蛋白的N端有由150個保守氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，C端有一個多樣化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域[11]。近年來，NAC蛋白因其在植物生長發(fā)育和對環(huán)境適應(yīng)的過程中發(fā)揮著多重作用而被深入研究[12]。NAC轉(zhuǎn)錄因子可以由轉(zhuǎn)錄水平上的某些順式作用元件和反式作用因子、轉(zhuǎn)錄后水平的 miRNA以及包括磷酸化、蛋白降解和二聚化的翻譯后調(diào)節(jié)水平調(diào)控[13]。許多NAC蛋白在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用[14]。擬南芥ANAC019、055和072響應(yīng)干旱、鹽和ABA等非生物脅迫[15]，擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子LOV1響應(yīng)冷脅迫[16]。過表達(dá)水稻SNAC1顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性[17]。

研究表明，擬南芥 miR164家族（ath-miR164a、b和c）調(diào)控 5個 NAC轉(zhuǎn)錄因子基因（CUC1，CUC2，NACl，at5g07680，和at5g61430）的mRNA的降解是植物器官邊界建成、側(cè)根的產(chǎn)生、營養(yǎng)和花器官的形成以及與年齡相關(guān)的細(xì)胞死亡所需的[5,18-19]。小麥miR164和其靶基因 NAC（miR164-NAC）對干旱脅迫的響應(yīng)呈負(fù)相關(guān)[20]。胡楊peu-miR164通過負(fù)調(diào)控PeNAC070來提高對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受力[21]。

近年來，在茶樹抗逆分子機(jī)理研究中，茶樹中2個NAC轉(zhuǎn)錄因子獲得克隆，并響應(yīng)溫度脅迫[22]，茶樹 miR164a也報(bào)道響應(yīng)低溫脅迫[23-24]。但是茶樹miR164a與NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中哪一個成員（miR164-NAC）存在調(diào)控關(guān)系以及如何響應(yīng)逆境脅迫尚不清楚。本研究根據(jù)低溫脅迫下茶樹小RNA高通量測序結(jié)果獲得的茶樹miR164a，進(jìn)行前體序列的克隆與分析；通過茶樹降解組測序獲得 miR164a靶基因，利用 RLM-5′RACE加以驗(yàn)證，并對靶基因進(jìn)行克隆與序列分析。探討茶樹miR164a及其靶基因在茶樹不同葉位、高溫脅迫和低溫脅迫中的表達(dá)模式，為揭示茶樹miR164a-NAC在茶樹生長發(fā)育、抗逆性中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

以盆栽1年生無性系茶樹品種舒茶早（C.sinensiscv.Shuchazao）為試驗(yàn)材料，溫度脅迫試驗(yàn)在人工氣候室中進(jìn)行[25]。選取芽、第1葉、第3葉、第5葉、第7葉，高溫脅迫處理溫度為白天38℃，晚上28℃，處理0、1、2、3、4 d（以處理0 d為對照）；低溫脅迫處理溫度為 4℃，處理 0、3、6、12、24 h（以處理0 h為對照），在各個時間點(diǎn)采集相同位置的葉片混樣，并迅速放入液氮中，儲存在-80℃冰箱備用[25]。

1.2 植物總RNA的提取

試驗(yàn)材料經(jīng)液氮研磨后，使用 miRcute miRNA提取分離試劑盒（TIANGEN，北京）提取茶樹總RNA。用核酸定量儀測定總RNA樣品的濃度、純度，用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA樣品完整性，儲存在-80℃冰箱備用[25]。總 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連）試劑盒。

1.3 miR164a前體序列的克隆及其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用植物MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取分離試劑盒（TaKaRa，大連）提取茶樹基因組 DNA，根據(jù)從本實(shí)驗(yàn)室茶樹低溫miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中得到的茶樹miR164a的前體基因序列：TCTAGATTCGT CGAACAGTAGGTGGGCAGCTCCTTGTTGG AGAAGCAGGGCACGTGCAAAAAGCTAAT GCTAGTAAGTTTTGTGTACGTGCTCCCCT TCTCCAACACGGGTTCCCTCACTCCCTCG ATTGCGAGCTC，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)其特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用RNAfold web server在線軟件（http://rna. tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWeb Suite/RNAfold.cgi）對 miR164a的前體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測[26]。

1.4 利用降解組測序數(shù)據(jù)預(yù)測靶基因

降解組測序和預(yù)測工作由聯(lián)川生物公司（LC Bio Tech，杭州）完成，步驟如下：首先將測序獲得的原始數(shù)據(jù)通過一系列數(shù)據(jù)處理得到可用于后續(xù)分析的可比對測序序列，然后將可比對序列與測序物種茶樹的 cDNA數(shù)據(jù)庫序列比對生成降解組密度文件（Degradome density file），通過Targetfinder靶基因預(yù)測軟件預(yù)測出與測序物種茶樹小RNA序列配對的靶基因mRNA序列，最后將預(yù)測的miRNA對應(yīng)的靶基因和生成降解組密度文件中的 mRNA進(jìn)行結(jié)合運(yùn)算，找出共同具有的mRNA，該mRNA即為miRNA的靶基因，并給出降解組的峰值分類和分值，并對產(chǎn)生的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行作圖（t-plots）[2]。

1.5 RLM-5′RACE驗(yàn)證miR164a靶基因裂解位點(diǎn)

從降解組測序數(shù)據(jù)中獲知 gi319875685（NAC21/22）為miR164a的靶基因，根據(jù)從茶樹轉(zhuǎn)錄組中獲得的 gi319875685（NAC21/22）的基因序列片段，用 EditSeq和 MegAlign軟件查詢 ORF框，根據(jù)其 ORF兩端的序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物（表1），測序驗(yàn)證該序列的準(zhǔn)確性。將獲得的cDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLASTn比對分析，結(jié)果顯示與公開的茶樹CsNAC1基因序列（GenBank:JN857066.1）相一致。

依據(jù)CsNAC1的 cDNA序列用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于RLM-5′RACE的引物（表1），RLM-5′RACE 試驗(yàn)參照 5′-Full RACE試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進(jìn)行，將擴(kuò)增出的特異產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序[2]。

1.6 靶基因CsNAC1序列生物信息學(xué)分析

用 EditSeq分析氨基酸序列。從 NCBI（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）得到保守結(jié)構(gòu)域，在 NCBI數(shù)據(jù)庫中分別用BLASTn和 BLASTx進(jìn)行核酸序列及氨基酸序列比對分析，用 MAFFT version 7（ https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）比對蛋白質(zhì)的同源性序列，擬南芥、水稻 NAC家族轉(zhuǎn)錄因子基因序列的獲得以及NAC結(jié)構(gòu)域和 miR164結(jié)合區(qū)域的確認(rèn)參照文獻(xiàn)[21,27]，將序列用ClustalX比對后，利用MEGA 6.06軟件并通過鄰接（Neighborjoining）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。

1.7 茶樹miR164a及其靶基因在茶樹中的表達(dá)

根據(jù)從本實(shí)驗(yàn)室茶樹低溫miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中獲得的茶樹 miR164a成熟序列設(shè)計(jì)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，應(yīng)用PrimerSelect軟件設(shè)計(jì) miRNA上游引物[28]。利用 PrimeScriptTMRT reagent kit（TaKaRa，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。熒光定量實(shí)驗(yàn)參照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進(jìn)行。pc-3p-222和CsEF-1α分別作為茶樹 miR164a qRT-PCR和靶基因CsNAC1qRT-PCR的內(nèi)參基因[29-30]。采用CFX96TMReal-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀檢測，每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)。驗(yàn)證目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增范圍，采用法進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算[25]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 Csn-miR164a前體序列的克隆及其二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

從本實(shí)驗(yàn)室茶樹低溫 miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中得到茶樹miR164a的前體序列，以茶樹總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果表明兩者序列完全一致，其長度為 126 bp（圖1）。Csn-miR164a前體序列的GC含量是53.97%，最小折疊自由能（Minimal folding free energies，MFE）為-65.60 kcal·mol-1，最小折疊自由能指數(shù)（Minimal folding free energies index，MEFi）為 0.96，MEFi大于 0.85，符合miRNA前體的特點(diǎn)[31]。RNAfold分析結(jié)果顯示，Csn-miR164a前體序列可折疊成較為典型的二級結(jié)構(gòu)，其成熟片段位于前體結(jié)構(gòu)的5′端莖結(jié)構(gòu)上（圖2），其成熟序列為：5′-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3′，21 bp，與miRbase 21數(shù)據(jù)庫中擬南芥、水稻和煙草等22個物種的miR164a成熟序列相一致。

2.2 茶樹Csn-miR164a靶基因的預(yù)測

將預(yù)測的Csn-miRNA164a對應(yīng)的靶基因和生成降解組密度文件中的 mRNA進(jìn)行結(jié)合運(yùn)算，找出共同具有的mRNA（Gi319875685）。對產(chǎn)生的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行作圖（Target plot，t-plot），Alignment Score（Target finder的打分）為2、Alignment Range（配對作用位點(diǎn)）為631～651、Cleaveage Site（剪切位點(diǎn)）為 642、Category（分型）為 0、P-value（P值）為0.003 95、Rep_Norm_reads（匹配多位點(diǎn)迚行位點(diǎn)歸一化后的reads）為18.667。

在t-plot圖中，miRNA剪切靶基因mRNA的位點(diǎn)用箭頭標(biāo)出，降解組測序預(yù)測的miR164a剪切位點(diǎn)位于靶基因mRNA的第642位核苷酸上（圖3）。

2.3 RLM-5′RACE驗(yàn)證茶樹miR164a靶基因

利用RLM-5′RACE對降解組測序預(yù)測的茶樹 miR164a靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)增出單一目的條帶（圖4），大小約為 231 bp，與預(yù)期的一致。為了準(zhǔn)確驗(yàn)證靶基因的裂解位點(diǎn)，挑取10個陽性克隆單菌落測序，測序結(jié)果全部顯示茶樹miR164a對靶基因的mRNA進(jìn)行單一剪切，與 miR164a結(jié)合的區(qū)域?yàn)?′-AGCAAGUGCCCUGCUUCUCCA-3′ ， 剪切位點(diǎn)位于miRNA/target mRNA結(jié)合區(qū)域的第10位核苷酸上，第10位和第11位堿基之間，與降解組測序結(jié)果一致（圖5）。

圖1 Csn-miR164a前體序列的克隆電泳圖Fig. 1 Electrophoresis results of Csn-MIR164a cloning

圖2 Csn-miR164a前體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Predicted secondary stem-loop structure of Csn-MIR164a

圖3 利用降解組測序技術(shù)獲得茶樹miR164a靶基因的t-plot圖Fig. 3 Target plots (t-plots) of miR164a target confirmed by degradome sequencing in Camellia sinensis

2.4 Csn-miR164a靶基因全長ORF序列的驗(yàn)證及其序列分析

從茶樹轉(zhuǎn)錄組中獲取個i319875685 mRNA序列，NCBI BLASTx比對顯示它具有完整的開放閱讀框（ORF）。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增驗(yàn)證其全長 ORF，PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期目的片段大小基本一致，約1 000 bp（圖6）。測序后，BLASTn分析表明，該序列與NCBI登錄的一個茶樹NAC1基因（登錄號：JN857066.1）的同源性達(dá)到99%。而與文獻(xiàn)報(bào)道的兩個茶樹NAC蛋白的同源性性分別只有30.26%和29.23%。該序列ORF長度為912 bp,編碼 303個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測如圖7所示，CsNAC1中的第 33位至第 109位氨基酸序列為 NAM 超家族的保守結(jié)構(gòu)域，這是NAC主要的特征功能域。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對CsNAC1氨基酸序列進(jìn)行 BLASTx比對，結(jié)果顯示它與木豆（XP_020223961.1）的NAC21/22氨基酸序列相似性最高，為 73%，與毛果楊（XP_002310688.1）、野生大豆（KHN26800.1）的NAC相似性分別為72%、71%。

用MAFFT version 7對擬南芥、水稻和茶樹3種植物的14條NAC家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，如圖8所示，這14條NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的N端均有NAC結(jié)構(gòu)域的5個亞結(jié)構(gòu)域A—E，C端含有miR164的結(jié)合區(qū)域[21,27]。

選取20種不同植物中的NAC21/22構(gòu)建進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，茶樹CsNAC1與藜麥（Chenopodium quinoa）NAC21/22的親緣關(guān)系最近（圖9）。

圖4 RLM-5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 4 PCR Production of RLM-5′RACE

圖5 miR164a靶基因裂解位點(diǎn)的驗(yàn)證Fig. 5 Identification of cleavage sites of miR164a target

圖6 茶樹CsNAC1 ORF擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 6 The PCR product of CsNAC1 ORF in tea plant

圖7 CsNAC1的保守結(jié)構(gòu)域Fig. 7 Conserved domain of CsNAC1 protein

圖8 茶樹、擬南芥和水稻miR164靶基因NAC的多序列比對Fig. 8 Multi-sequence alignments of the miR164 NAC target genes in tea plant, rice and Arabidopsis thaliana

圖9 茶樹CsNAC1的進(jìn)化樹分析Fig. 9 Phylogenetic tree analysis of CsNAC1

2.4 茶樹miR164a和其靶基因CsNAC1表達(dá)模式分析

2.4.1 茶樹Csn-miR164a和CsNAC1在不同葉位中的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR，檢測了Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在茶樹不同葉位的表達(dá)情況（圖10）。結(jié)果顯示，Csn-miR164a和CsNAC1在茶樹不同葉位的表達(dá)存在差異，Csn-miR164a在芽中的表達(dá)量最高，而靶基因CsNAC1在芽中的表達(dá)量最低。隨著葉片的發(fā)育，Csn-miR164a隨著葉位的降低表達(dá)量依次降低，在第7葉位（老葉）的表達(dá)量最低，僅為芽的47%。CsNAC1的表達(dá)量隨葉位的降低表達(dá)量逐漸增高，在第7葉位表達(dá)量最高，是芽的8倍?？梢?，Csn-miR164a隨著葉片的衰老表達(dá)量下降，而CsNAC1與Csn-miR164a呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，隨著葉片的衰老表達(dá)量增加。

2.4.2Csn-miR164a和CsNAC1對高溫脅迫的響應(yīng)

從圖11可以看出，高溫誘導(dǎo)茶樹miR164a及其靶基因CsNAC1的表達(dá)。在脅迫處理的第1天高溫誘導(dǎo)miR164a的表達(dá)顯著下調(diào)，表達(dá)量為對照（0 d）的 58%，靶基因CsNAC1的表達(dá)量顯著上調(diào)，相對表達(dá)量是對照的3.5倍。miR164a表達(dá)量都在高溫脅迫處理的第4天達(dá)到最低，僅為對照的 46%，靶基因CsNAC1在第4天的表達(dá)量最高，是對照的6.6倍。在高溫脅迫處理下茶樹 miR164a的表達(dá)量隨脅迫處理時間的增加呈下調(diào)趨勢，而靶基因CsNAC1的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢。茶樹在高溫脅迫處理下，靶基因CsNAC1的表達(dá)量與Csn-miR164a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。

2.4.3Csn-miR64a和CsNAC1對低溫脅迫的響應(yīng)

如圖12所示，低溫誘導(dǎo)茶樹miR164a及其靶基因CsNAC1的表達(dá)，在低溫處理3 h后，Csn-miR164a的表達(dá)量顯著下調(diào)，僅為對照（0 h）的42%，CsNAC1上調(diào)表達(dá)，相對表達(dá)量是對照的5.7倍。在低溫處理24 h后，miR164a的表達(dá)量達(dá)到最低，相對表達(dá)量為對照的41%，而CsNAC1的表達(dá)量達(dá)到最高，相對表達(dá)量是對照的 20.3倍。在低溫脅迫處理下，靶基因CsNAC1的表達(dá)量與Csn-miR164a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

研究表明許多高度保守的miRNA響應(yīng)逆境脅迫并有助于植物適應(yīng)環(huán)境，miRNA靶基因大部分是轉(zhuǎn)錄因子，如AP2、NF-Y、MYB和NAC。植物miR164及其靶基因NAC基因在植物中是保守的，NAC蛋白代表一個植物特有的廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，其調(diào)控植物的發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)[21]。在擬南芥中，miR164家族靶向7個NAC基因的轉(zhuǎn)錄物；在水稻中，miR164家族與6個NAC基因互補(bǔ)；在玉米中，發(fā)現(xiàn)7個NAC基因是預(yù)測的miR164的靶基因[21]。在茶樹中，初步發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族有45個成員[32]，然而本試驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證一個 NAC轉(zhuǎn)錄因子為茶樹 miR164a的靶基因，是否還存在其它家族成員是 miR164a的靶基因，需要進(jìn)一步研究。

圖10 Csn-miR164a和其靶基因CsNAC1在茶樹不同葉位中的表達(dá)分析Fig. 10 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in different leaf position of tea plant

圖11 茶樹Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在高溫脅迫下的表達(dá)分析Fig. 11 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in tea plant under heat stress

圖12 茶樹Csn-miR164a及其靶基因CsNAC1在低溫脅迫下的表達(dá)分析Fig. 12 Expression analysis of Csn-miR164a and target gene CsNAC1 in tea plant under cold stress

在水稻中，RLM-RACE分析顯示miR164定向剪切NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員OMTN1和OMTN2的剪切位點(diǎn)在第 10和 11位堿基之間[27]。在胡楊中，5′-RACE分析顯示miR164定向剪切PeNAC070、PeNAC012和PeNAC028mRNA，剪切位點(diǎn)在miR164第10和11位堿基之間[21]。在光皮樺中，運(yùn)用5′-RACE驗(yàn)證了NAC1為miR164靶基因，剪切位點(diǎn)也在第10和11位堿基之間[33]。在本研究中，我們通過降解組測序數(shù)據(jù)和RLM-5′-RACE驗(yàn)證，獲知茶樹miR164a定向剪切CsNAC1，剪切位點(diǎn)同樣也在 miR164a第 10和 11位堿基之間。這表明miR164剪切位點(diǎn)可能是非常保守，沒有物種差異。

miR164表達(dá)的時序性和組織特異性可能決定了植物組織和細(xì)胞的功能特異性，對細(xì)胞生長和組織發(fā)育的調(diào)節(jié)起重要作用[3]。在擬南芥中，miR164隨著擬南芥葉片的衰老表達(dá)量下降[19]，甜菊新葉中miR164的表達(dá)量高于老葉[34]。在本研究中，隨著茶樹葉片的衰老，miR164表達(dá)量也呈下降趨勢，與其他植物一致，且Csn-miR164a與CsNAC1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測Csn-miR164a參與茶樹葉片生長發(fā)育過程，但是起何種作用尚不清楚。

植物miR164通過調(diào)控靶基因NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆脅迫[2]。對毛竹進(jìn)行高溫（42℃）和低溫（4℃）處理，發(fā)現(xiàn) miR164b的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)，其靶基因PeNAC1上調(diào)表達(dá)[35]。對大豆進(jìn)行低溫（4℃）處理，miR164也是下調(diào)表達(dá)[36]。與毛竹、大豆一致，茶樹Csn-miR164a低溫溫度下調(diào)表達(dá)，靶基因CsNAC1上調(diào)表達(dá)，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。但是 0℃低溫處理下甜楊幼苗、4℃低溫處理下小麥中 miR164a的表達(dá)均上調(diào)[37-38]，這表明不同物種miR164對低溫脅迫響應(yīng)模式存在差異。

本研究初步揭示了Csn-miR164a-CsNAC1參與茶樹葉片的生長發(fā)育過程和響應(yīng)溫度脅迫。但是，茶樹miR164a功能與作用仍需通過過表達(dá)轉(zhuǎn)基因等手段進(jìn)一步的研究，miR164a-NAC1通過何種調(diào)控途徑來響應(yīng)溫度脅迫，提高茶樹抗逆性的分子機(jī)制也有待深入研究。