吳依婷，姚傳威，鄧波俠，張 霞，李勝華，鄒 娟，付 明

(懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418000)

植物內(nèi)生菌是指在整個(gè)生活史或是生活史的某一階段可以定殖于宿主植物健康細(xì)胞之間或者細(xì)胞內(nèi)，卻不危害宿主的微生物，是一類(lèi)未充分開(kāi)發(fā)利用的重要微生物資源[1-3]。內(nèi)生菌靠入侵植物組織獲取營(yíng)養(yǎng)，并得到宿主的保護(hù)，同時(shí)產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物來(lái)提高宿主的抗逆性能。近年來(lái)，生物防治以其安全、高效及無(wú)污染等特點(diǎn)成為植物病害防治的重要途徑。國(guó)內(nèi)外有關(guān)內(nèi)生細(xì)菌的生防作用研究報(bào)道最多的是其對(duì)植物土傳病害的抑制作用?，F(xiàn)已從油茶、辣椒、棉花、玉米、油菜、馬鈴薯等多種作物體內(nèi)分離篩選到對(duì)油茶根腐病、辣椒炭疽病、棉花黃萎病、棉花枯萎病、油菜黃萎病、馬鈴薯軟腐病、馬鈴薯環(huán)腐病等常見(jiàn)真菌和細(xì)菌病害具有良好抑制效果的內(nèi)生細(xì)菌[4-7]。

黃精(Polygonatumsibiricum)為百合科多年生草本植物，是重要的藥食同源植物。2016年，國(guó)家黃精標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)項(xiàng)目落戶(hù)懷化洪江市，該項(xiàng)目同時(shí)也是懷化地區(qū)精準(zhǔn)扶貧項(xiàng)目。洪江市現(xiàn)有黃精種植面積667 hm2[8]。然而黃精生長(zhǎng)期需3 a以上，常年種植易出現(xiàn)根腐病病害，嚴(yán)重影響黃精的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至導(dǎo)致黃精根莖腐爛絕收。根據(jù)多年考察，我們發(fā)現(xiàn)野生黃精不易出現(xiàn)根腐病，可能是因?yàn)橐吧S精中具有抑制根腐病的內(nèi)生菌。目前，關(guān)于黃精根腐病菌鮮有研究報(bào)道。本研究從雪峰山區(qū)野生黃精中分離出內(nèi)生細(xì)菌，篩選出對(duì)黃精根腐病有明顯抑制作用的菌株A8，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，以期為黃精根腐病的生物防治提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

根腐病黃精植株采集于湖南省懷化洪江市黃精種植基地，健壯的野生黃精植株采集于雪峰山區(qū)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)和LB培養(yǎng)基[9]。

1.2 黃精內(nèi)生細(xì)菌和根腐病菌株的分離

1.2.1 黃精內(nèi)生細(xì)菌的分離

用流水清洗健壯的黃精植株塊莖表面的泥土殘漬，晾干水分。將黃精塊莖放入75%乙醇中處理3 min，無(wú)菌水沖去殘留的乙醇；再置于0.1%升汞溶液中浸泡1 min，無(wú)菌水沖去殘留的升汞溶液，瀝去水分。在無(wú)菌條件下，將處理過(guò)的塊莖磨成勻漿，用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍后涂布于NA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～5 d。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出可見(jiàn)菌落時(shí)，及時(shí)挑取菌落，在LB培養(yǎng)基平板上多次劃線(xiàn)分離，獲得純培養(yǎng)物。

表面消毒效果的檢查：取最后一遍沖洗黃精塊莖的無(wú)菌水，涂布于NA培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)2 d后無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明消毒徹底，樣品表面已無(wú)附生菌。

1.2.2 黃精根腐病菌株的分離

參考檀國(guó)印等[7]報(bào)道的方法，分離黃精根腐病菌株。

1.2.3 平板對(duì)峙檢測(cè)

按宋光桃等[4]的方法，在PDA平板中央接種直徑6 mm的黃精根腐病分離菌菌餅，在距離菌餅2.5 cm處點(diǎn)種分離的內(nèi)生細(xì)菌，每皿接1株內(nèi)生細(xì)菌，重復(fù)3次，以不接內(nèi)生菌為對(duì)照。于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照中的根腐病分離菌長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，測(cè)量?jī)?nèi)生菌的抑菌圈直徑。

1.3 根腐病菌株和內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌和根腐菌的形態(tài)學(xué)鑒定

按照沈萍等[9]的方法，無(wú)菌條件下，將根腐菌點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)3～5 d。取一滴乳酸石碳酸棉蘭染液滴于載玻片上，用鑷子取培養(yǎng)物少許，在50%乙醇中浸一下以除去脫落的孢子，然后將培養(yǎng)物置于載玻片上的染液中，用大頭針小心地將菌絲分開(kāi)，加蓋玻片，顯微鏡下觀察根腐菌菌絲體及孢子形態(tài)。

將內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)物置于LB平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色和芽胞染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小、芽胞形狀和著生部位；將內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)物置于28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)。參照何紅等[5]的方法進(jìn)行菌株的生理生化試驗(yàn)。

1.3.2 根腐病分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

按照文獻(xiàn)[10]報(bào)道的方法收集黃精根腐病分離菌的菌絲體并提取其DNA。選用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS)擴(kuò)增的通用引物ITS5(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR擴(kuò)增分離菌的ITS區(qū)段。反應(yīng)體系如下： 1 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，0.2 μLTaq酶(5 U·μL-1)，2.5 μL 10×PCR緩沖液，0.5 μL引物ITS4(10 μmol·L-1)，0.5 μL引物ITS5(10 μmol·L-1)，0.5 μL(約20 ng·μL-1)基因組DNA，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。切膠回收目標(biāo)條帶，由擎科生物技術(shù)(長(zhǎng)沙)有限公司完成測(cè)序工作。

翻譯延伸因子EF-1a序列常用來(lái)鑒定鐮刀菌屬真菌[11]，且EF-1a在物種鑒定方面有高分辨能力，較以往的ITS序列有較多的種間變異，適于作為系統(tǒng)進(jìn)化研究的遺傳標(biāo)記[11-12]。選用鐮刀菌EF-1a擴(kuò)增的通用引物EF-1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和 EF-2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)對(duì)延伸因子EF-1a區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物反應(yīng)在 25 μL體系中進(jìn)行，各組分如下：1 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，0.2 μLTaq酶(5 U·μL-1)，2.5 μL 10×PCR緩沖液，0.5 μL引物EF-1(10 μmol·L-1)，0.5 μL引物EF-2(10 μmol·L-1)，1.0 μL(約20 ng·μL-1)基因組DNA，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。切膠回收目標(biāo)條帶，由擎科生物技術(shù)(長(zhǎng)沙)有限公司完成測(cè)序工作。利用Clustal X程序，將黃精根腐病分離菌的EF-1a序列與GenBank EF-1a序列進(jìn)行同源性比較，確定該分離菌的分類(lèi)地位。最后采用鄰位加入法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建基于EF-1a序列的黃精根腐病分離菌株和同屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選擇Bootstrap method測(cè)試法，1 000次重復(fù)，Kimura 2-parameter模型，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

1.3.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。反應(yīng)體系如下：基因組DNA模板1 μL，引物各1 μL，Taq酶0.25 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl24 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。切膠回收目標(biāo)條帶，測(cè)序工作由擎科生物技術(shù)(長(zhǎng)沙)有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，以確定菌種分類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精根腐病菌株的分離鑒定

將黃精根腐病菌株中獲得的分離菌編號(hào)為HF2。HF2菌株在PDA上生長(zhǎng)較快，5 d可長(zhǎng)滿(mǎn)直徑90 mm的培養(yǎng)皿。菌落圓形，氣生菌絲呈白色，絨狀，茂密，有分枝，培養(yǎng)后期菌落背面產(chǎn)生色素，培養(yǎng)皿背面呈紫黑色(圖1-a、b)；分生孢子在氣生菌絲分枝的梗上形成，單孢有隔、卵形，直或稍彎，頂端稍尖，基部鈍，大小(5.7～8.6) μm×(1.3～1.9) μm；厚垣孢子球形，插生于菌絲體間，單頂生或串生，大小(4.8～11.9) μm×(5.7～12.4) μm(圖1-c、d)。

a、b，PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d的HF2菌絲；c，HF2菌株的菌絲和分生孢子(400×)；d，HF2菌株的菌絲和厚垣孢子(400×)。a and b，The culture of strain HF2 grown on PDA medium for 5 days; c，Micrograph of mycelia and conidiospores of strain HF2 (400×); d，Micrograph of mycelia and chlamydospores of strain HF2 (400×).圖1 黃精根腐病菌株的菌落和分生孢子形態(tài)Fig.1 Colonies and conidiospores of strain HF2 isolated from Polygonatum sibiricum root rot

用引物ITS4和ITS5對(duì)HF2的ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)約為579 bp的DNA片段。將比較排列后的序列提交到GenBank中，獲得序列登錄號(hào)(MH001545)，將該序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，顯示該菌株與GenBank中已登錄的尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)序列的同源性為99%，從而在分子水平上證明分離獲得的菌株為Fusariumsp.。為了進(jìn)一步鑒定該分離菌，對(duì)其EF-1a延伸因子的基因序列進(jìn)行分析，片段大小為685 bp，提交到GenBank中，獲得序列登錄號(hào)(MH006685)，其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他F.oxysporum的EF-1a延伸因子序列相似性為100%(圖2)。

從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可分為兩個(gè)主要分支。第一支又分為兩大類(lèi)群，其中一類(lèi)由本種HF2菌株、Fusariumoxysporum、F.verticillioides、F.incarnatum構(gòu)成；另一類(lèi)由F.globosum、F.proliferatum構(gòu)成。第二支由F.equiseti、F.solani、F.subglutinans、F.gaditjirri、F.thapsinum構(gòu)成。本種與已報(bào)道的F.oxysporum以99%的相似度聚類(lèi)在一起，而Fusarium屬的F.equiseti、F.solani、F.subglutinans、F.gaditjirri、F.thapsinum則以較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的外圍。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)黃精根腐病菌的體外抑制作用

圖2 NJ法構(gòu)建的基于EF-1a序列的HF2菌株和其他鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic dendrogram of isolate HF2 and other isolates of Fusarium spp.constructed by using neighbor-joining (NJ) method based on EF-1a sequences

從健壯野生黃精中篩選獲得了40株內(nèi)生細(xì)菌，以黃精根腐病分離菌HF2為目標(biāo)菌，用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)試了這40株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)HF2的抑制作用。結(jié)果顯示，A3、A6、A7、A8、A11、A12、A17、B8、C5和C8這10株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)HF2具有較強(qiáng)的抑制作用，其中抑菌圈大于 10 mm的有 4株，分別為A6、A8、A11、A17(表1)。這10株菌株多為乳白色，菌落不透明，邊緣不整齊。不同菌株對(duì)HF2的抑菌效果不同，除A12、B8、C8無(wú)顯著差異外，其他各菌株均存在顯著差異，其中菌株A8的抑菌效果最好。

2.3 A8菌株的初步鑒定及其對(duì)黃精根腐菌的抑制

在LB瓊脂平板上，A8菌落表面粗糙不規(guī)則，邊緣擴(kuò)散狀，不透明，污白色，易挑起，不分泌色素，見(jiàn)圖3-a。培養(yǎng)24 h的菌體呈柱狀，大小為1.1 μm×3.2 μm，革蘭氏染色為陽(yáng)性，芽孢中生，橢圓形，見(jiàn)圖3-b。淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和油脂水解試驗(yàn)都為陽(yáng)性，甲基紅反應(yīng)和乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P.試驗(yàn))為陰性，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌Bacillussp.。

平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)如圖3-c所示，A8對(duì)黃精根腐分離菌(F.oxysporum)HF2的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，可以產(chǎn)生明顯的抑菌帶，A8菌落邊緣的HF2菌絲生長(zhǎng)緩慢，正常生長(zhǎng)的HF2菌絲呈圓形擴(kuò)展。

對(duì)10株內(nèi)生細(xì)菌(A3、A6、A7、A8、A11、A12、A17、B8、C5和C8)的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列經(jīng)過(guò)Clustal X比較排列后，提交到GenBank中，獲得序列登錄號(hào)分別為MF509844、MF509831、MF509832、MF509847、MF509833、MF509834、MF509837、MF509839、MF509843、MF509845。將該序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，顯示A6、A11、A12、A8、A7、C5、A17、A3、B8菌株與Bacillussp.多個(gè)菌株的序列相似性均為99%，確定這些菌株為Bacillussp.。C8與Herbaspirillumsp.多個(gè)菌株的序列相似性為98%，確定該菌為草螺菌屬(Herbaspirillumsp.)。其中對(duì)黃精根腐病菌具有高抑菌活性的內(nèi)生菌株A8，綜合其菌落形態(tài)特征、染色結(jié)果和16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果，確定該菌株為Bacillussubtilis。

表1 內(nèi)生細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上的菌落特征及抑菌效果

a，菌株A8的菌落形態(tài)圖；b，菌株A8的顯微攝影圖(10×100)；c，HF2受A8抑制的菌落形態(tài)。a，The colonial morphology of strain A8; b，Microphotograph of strain A8; c，Colony of strain HF2 inhibited by strain A8 in culture plate.圖3 菌株A8的菌落形態(tài)、顯微攝影圖和對(duì)HF2的抑制作用Fig.3 Colonial morphology，microphotograph and inhibitory effect on HF2 of strain A8

圖4 NJ法構(gòu)建的基于16S rDNA序列的內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic dendrogram of endophytic bacteria constructed by using neighbor-joining (NJ) method based on 16S rDNA sequences

3 討論

鐮刀菌能引起作物發(fā)生病害的報(bào)道近年來(lái)逐漸增多，但未見(jiàn)引起黃精根腐病的報(bào)道。本研究首次研究了黃精根腐病，發(fā)現(xiàn)湖南洪江黃精根腐病的主要分離菌為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，該菌常引發(fā)作物根腐病害[7，11-12]。F.oxysporum是一類(lèi)形態(tài)比較特殊的鐮刀菌，本試驗(yàn)采用ITS聯(lián)合EF-1a序列的分子鑒定，再結(jié)合顯微形態(tài)觀察，達(dá)到鑒定的目的，為進(jìn)一步研究黃精鐮刀菌根腐病的防治提供了依據(jù)。

已有研究表明，植物內(nèi)生菌的防病作用機(jī)制主要有4種：(1)通過(guò)分泌抗菌活性物質(zhì)，如脂多肽、硝砒咯菌素、丁酰內(nèi)酯、吩嗪羧酸等產(chǎn)生拮抗作用[13-16]，或者產(chǎn)生一些水解酶類(lèi)，如幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等，酶解病原菌的細(xì)胞壁或降解其他致病因子如毒素等，從而抑制病原菌生長(zhǎng)[17-18]；(2)占據(jù)空間位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)生細(xì)菌在植物組織中繁衍和定殖，優(yōu)先占領(lǐng)植物體內(nèi)有限的生存位點(diǎn)，可以有效地阻止病原微生物的侵染，達(dá)到抑菌效果[19-20]；(3)在植物受到病菌侵襲時(shí)，定殖于植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，而且不會(huì)對(duì)寄主植物產(chǎn)生不良影響[21-22]；(4)通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗逆能力，從而間接提高植物的抗病性[23-24]。植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌共計(jì)54個(gè)屬129個(gè)種，其中芽孢桿菌最為常見(jiàn)[25]。由于芽孢桿菌具有繁殖速度快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)、能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)、易在植物體內(nèi)定殖和不污染環(huán)境等突出特性，已成為一種理想的微生態(tài)制劑菌種，廣泛用于防治植物病害，可有效減少或替代化學(xué)農(nóng)藥在植物種植過(guò)程中的使用。草螺菌常見(jiàn)于禾谷類(lèi)植物和雙子葉植物莖或根部，多數(shù)草螺菌具有固氮或產(chǎn)生植物激素的功能并具有使宿主植物增產(chǎn)的潛能。本研究篩選出10株對(duì)黃精根腐病分離菌具有較強(qiáng)抑制作用的黃精內(nèi)生細(xì)菌，其中，A6、A11、A12、A8、A7、C5、A17、A3、B8菌株為Bacillussp.，內(nèi)生菌株A8對(duì)黃精根腐病菌株具有較高的抗菌活性，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，但菌株A8的林間防治效果及其對(duì)黃精根腐病菌的防病作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。C8為Herbaspirillumsp.，其所屬類(lèi)群還有待于進(jìn)一步鑒定，是否具有固氮或促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能還有待研究。