呂智航，徐偉慧，王志剛，*，王春龍，劉澤平，陳文晶，史一然，2

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江，齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

我國是世界上西瓜產(chǎn)量最大的國家，年西瓜種植面積近200萬 hm2，年產(chǎn)量7 000 余萬t[1]。西瓜枯萎病是制約西瓜生產(chǎn)的主要因素之一，該病由西瓜?；图怄哏牭毒?Fusariumoxyxporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON)引起，在田間的發(fā)病率為10%～30%，在重茬區(qū)發(fā)病率尤重，可致減產(chǎn)20%～50%，甚至絕收[2-3]。

國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)西瓜枯萎病問題，從抗病育種[4]、嫁接防治[5]、化學(xué)防治[6]、農(nóng)業(yè)防治[7]等方面開展了一系列研究，但是這些方法各有利弊?？共∮N周期長，成本高；嫁接果實(shí)口感不好，含糖量低；農(nóng)業(yè)防治防效慢；化學(xué)防治仍是目前最有效、簡便的防治措施?；瘜W(xué)農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中做出了巨大貢獻(xiàn)[8]，但同時(shí)也產(chǎn)生了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、傷害非靶標(biāo)生物，甚至破環(huán)生態(tài)平衡等問題。隨著人們環(huán)保意識(shí)及對(duì)食品安全關(guān)注度的增強(qiáng)，化學(xué)殺菌劑的使用受到了極大的限制[9]，以微生物及其代謝產(chǎn)物為主的生物防治手段已成為植物病害防治的發(fā)展方向[10]。生防菌的篩選是生物防治中重要的一環(huán)，也是生防成功的關(guān)鍵所在。

植物多樣性能增加土壤有益微生物群落的多樣性和種群數(shù)量。利用植物多樣性篩選并利用植物根際有益菌，是控制土傳病害的有效方法之一[11]，也是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)的植物根際土壤為試材，篩選能抑制FON的菌株并研究其抑菌特性，旨在為西瓜枯萎病的生物防治應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為生防菌劑的開發(fā)與利用提供新的資源和途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加瓊脂，120 ℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 8 g，蒸餾水1 000 mL，120 ℃滅菌20 min。

磷酸緩沖液(pH 7.2)：稱取磷酸氫二鈉138 g和磷酸二氫鈉142 g，分別溶于適量水中，待其溶解后定容至1 L。量取72 mL磷酸氫二鈉溶液和28 mL磷酸二氫鈉溶液，混合后即得到pH 7.2的磷酸緩沖液。

2.5%戊二醛緩沖溶液：0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.2)50 mL+25%戊二醛溶液10 mL，定容至100 mL。

供試土壤：黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)植物根際土壤。

1.2 FON抑制菌的分離與鑒定

取黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)的植物根際土壤，經(jīng)梯度稀釋后，分離得到的菌株分別與FON進(jìn)行對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，選取抑菌效果好的菌株，通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。菌株測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，包括細(xì)菌基因組DNA的抽提、電泳檢測(cè)、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)、測(cè)序切膠純化測(cè)序、分析結(jié)果和序列拼接。測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1 000)。

1.3 MLY01無菌濾液對(duì)FON的抑制作用分析

將MLY01菌體接入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，制成種子液。再將1 mL種子液接種入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，在10 000 r·min-1、4 ℃的條件下離心15 min，取上清液過0.22 μm濾器，將無菌濾液存放于4 ℃冰箱備用。

1.3.1 對(duì)菌絲生長的影響

將未凝固的PDA培養(yǎng)基和無菌濾液按照1∶1和3∶1的比例混合倒平板，以培養(yǎng)基與無菌水按同樣比例混合作為空白對(duì)照，待培養(yǎng)基凝固后，取直徑相同的FON菌餅，接入已凝固的培養(yǎng)基中央，每組3個(gè)平行。接種完成后用封口膜封口，29 ℃培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑。

1.3.2 對(duì)FON菌絲干重的影響

將PDA培養(yǎng)基和MLY01無菌濾液按1∶1 和3∶1的比例混合，倒入三角瓶中，每瓶接入直徑相同的FON菌絲塊，30 ℃恒溫、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d，以培養(yǎng)基和無菌水按同樣比例混合作為空白對(duì)照。每組3個(gè)平行，5 d后將培養(yǎng)液以10 000 r·min-1離心15 min收集菌體，80 ℃烘至恒重，用天平稱其質(zhì)量。

1.3.3 對(duì)FON孢子萌發(fā)的影響

挑取PDA平板中培養(yǎng)5 d的FON菌絲，懸浮于無菌水中，經(jīng)過6層紗布過濾后，室溫下10 000 r·min-1離心5 min收集孢子，用PDA培養(yǎng)基制備孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至106cfu·mL-1。將MLY01無菌濾液與FON的孢子懸液按1∶1比例混合，倒入無菌凹玻片中，以無菌水與FON的孢子懸液按同樣比例混合作為空白對(duì)照，30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每組3個(gè)平行。分別在12、24、36 h時(shí)鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率和萌發(fā)抑制率。

1.3.4 對(duì)FON形態(tài)的影響

按照1.3.3節(jié)的方法制備FON孢子懸液。將MLY01的無菌濾液與FON的孢子懸液按1∶1比例混合，放入無菌凹玻片中，然后置于培養(yǎng)皿中，30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h，以無菌水與FON的孢子懸液按同樣比例混合作為空白對(duì)照。分別吸取混合液滴在蓋玻片上風(fēng)干，用2.5%戊二醛緩沖液固定，4 ℃冰箱過夜，再用pH 7.2的磷酸緩沖液固定，沖洗2次，依次將樣品置于濃度為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中脫水置換，每級(jí)脫水時(shí)間10～15 min，最后一次用100%乙醇加無水硫酸銅脫水置換10～15 min，置于冷凍室固化一夜，每組3個(gè)平行，掃描電鏡下觀察其形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FON抑制菌的分離與鑒定

通過對(duì)峙實(shí)驗(yàn)獲得一株抑菌效果好的菌株，其菌落形態(tài)如圖1所示。根據(jù)16S rDNA的測(cè)序結(jié)果和同源性比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株MLY01與BacilluslicheniformisP15的一致性為100%，構(gòu)建菌株MLY01的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，基于菌株的形態(tài)學(xué)特征和生物信息學(xué)分析，將菌株確定為BacilluslicheniformisMLY01。

2.2 MLY01無菌濾液對(duì)FON的抑制效果

2.2.1 對(duì)菌絲生長的影響

當(dāng)培養(yǎng)基與無菌濾液比例為3∶1時(shí)，對(duì)照FON菌落直徑為34.31 mm，處理FON菌落直徑為24.24 mm，抑菌率為29.35%(P<0.05)(圖3)。當(dāng)培養(yǎng)基與無菌濾液比例為1∶1時(shí)，對(duì)照的FON菌落直徑為30.52 mm，處理的 FON菌落直徑為8.59 mm，抑菌率為71.85%(P<0.05)。

圖1 菌株MLY01在LB平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain MLY01 on LB plate

圖2 MYL01和相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Established phylogenetic tree by MYL01 and related strains

柱上無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05.The same as below.圖3 MLY01無菌濾液對(duì)FON菌絲生長的影響Fig.3 Effect of MLY01 cell-free cultural filtrate on mycelium growth of FON

2.2.2 對(duì)FON菌絲生物量的影響

當(dāng)培養(yǎng)基與無菌濾液比例為3∶1時(shí)，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)5 d后，對(duì)照FON菌絲干重為1.03 g，處理的FON菌絲干重為0.83 g，菌株MYL01無菌濾液對(duì)FON菌絲生物量抑制率為19.42%(P<0.05)(圖4)。當(dāng)培養(yǎng)基與無菌濾液比例為1∶1時(shí)，對(duì)照FON菌絲干重為0.88 g，處理的FON菌絲干重為0.18 g，抑制率達(dá)到79.55%(P<0.05)。抑制強(qiáng)度隨無菌濾液稀釋倍數(shù)增加而下降。

2.2.3 對(duì)FON孢子萌發(fā)的影響

圖4 MLY01無菌濾液對(duì)FON菌絲生物量的影響Fig.4 Effect of cell-free cultural filtrate of MLY01 on FON mycelial biomass

FON孢子懸液與MLY01無菌濾液以1∶1比例混合，培養(yǎng)12 h，對(duì)照FON孢子萌發(fā)率為54.47%，處理的FON孢子萌發(fā)率為36.51%，孢子萌發(fā)抑制率為32.97%(圖5)；培養(yǎng)24 h，對(duì)照FON孢子萌發(fā)率為78.34%，處理FON的孢子萌發(fā)率為30.55%，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到61.00%；培養(yǎng)36 h，對(duì)照FON孢子萌發(fā)率為87.03%，處理FON的孢子萌發(fā)率為20.18%，孢子萌發(fā)抑制率為76.81%。

2.2.4 對(duì)FON形態(tài)的影響

FON孢子懸液與無菌水按1∶1比例混合，培養(yǎng)12 h后，掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照中孢子數(shù)目較多，菌絲粗細(xì)均一，表面光滑(圖6-A，C)，而經(jīng)MLY01無菌濾液處理12 h后，孢子數(shù)目減少，菌絲表面粗糙，且畸形扭曲，表面有多處凹陷(圖6-B，D)。說明MLY01無菌濾液對(duì)FON孢子和菌絲有直接破壞作用，從而抑制FON的生長。

圖5 MLY01無菌濾液對(duì)FON孢子12 h(A)、24 h(B)、36 h(C)萌發(fā)的影響Fig.5 Effect of cell-free cultural filtrate of MLY01 spore germination of FON after 12 h (A)，24 h (B)，36 h (C)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以黑龍江省扎龍自然保護(hù)區(qū)植物根際土壤為試材，從中篩選到一株能抑制FON的菌株，經(jīng)16S rDNA序列鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定該菌株為BacilluslicheniformisMLY01。有關(guān)地衣芽孢桿菌抑制植物病原菌的報(bào)道很多，如地衣芽孢桿菌能抑制煙草黑脛病、棉花枯萎病與黃萎病、辣椒疫病與葉斑病、稻瘟病、馬鈴薯晚疫病等多種植物病害病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)[12-18]。菌絲生長實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基與MLY01無菌濾液按1∶1 比例混合時(shí)，抑菌率可達(dá)71.85%，比抑菌靈等化學(xué)藥劑的抑菌率高20.86%[19]，比萎縮芽孢桿菌SF1對(duì)FON的抑菌率平均高出15.85%[20]，比拮抗細(xì)菌TGRE24對(duì)鐮刀菌的抑菌率高出15.9%[21]，比KlebsillaASP -15對(duì)FON的抑菌率高出54.15%[22]。MLY01無菌濾液與FON孢子懸浮液按1∶1比例混合，培養(yǎng)36 h后孢子萌發(fā)抑制率達(dá)76.81%，比三唑酮對(duì)FON的孢子萌發(fā)抑制率高出37.06%[23]，比BacillusamyloliquefaciensHRH317對(duì)FON孢子的萌發(fā)抑制率高出21.01%[24]，比青霉菌對(duì)FON的孢子萌發(fā)抑制率高出4.84%[25]。生物量實(shí)驗(yàn)中，MLY01無菌濾液對(duì)FON的抑制率達(dá)到79.55%，進(jìn)一步驗(yàn)證了BacilluslicheniformisMLY01對(duì)FON的抑制作用。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)會(huì)造成病原真菌菌絲表面粗糙，且畸形扭曲，表面有多處凹陷現(xiàn)象，進(jìn)而抑制孢子的萌發(fā)和菌絲的生長[26-27]，與本實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡下所觀察的現(xiàn)象一致，證明BacilluslicheniformisMLY01無菌濾液能夠?qū)ON孢子和菌絲細(xì)胞表面造成損傷。這可能是BacilluslicheniformisMLY01無菌濾液抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長，造成FON生物量減少的直接原因。

A，對(duì)照(2 000倍)；B，加入無菌濾液(2 000倍)；C，對(duì)照(3 500倍)；D，加入無菌濾液(3 500倍)。A，Control (2 000 times); B，Adding aseptic filtrate (2 000 times); C，Control (3 500 times); D，Adding aseptic filtrate (3 500 times).圖6 MLY01無菌濾液對(duì)FON形態(tài)的影響Fig.6 Effect of cell-free cultural filtrate of MLY01 on FON morphology

本實(shí)驗(yàn)證明BacilluslicheniformisMLY01無菌濾液能抑制FON生長，顯示出了很好的抑制活性，是一株極具生防開發(fā)潛力的菌株。但要將該菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)尤其是西瓜枯萎病防治上，還須對(duì)其發(fā)酵工藝、定殖行為、抑菌活性成分、作用機(jī)制及應(yīng)用方式等進(jìn)行深入研究。