任衛(wèi)合，任穩(wěn)穩(wěn)，馬博妍，高成宏，李宏旭，劉麗霞，曹 忻，張 麗

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)又稱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族成員之一[1]，特異性表達(dá)于動(dòng)物骨骼肌中，屬骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，能抑制肌肉的生長(zhǎng)[2]。McPherron等[1]首先從小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中克隆得到MSTN基因，并發(fā)現(xiàn)該基因缺失小鼠的體質(zhì)量約為正常小鼠的2倍。人MSTN基因全長(zhǎng)7.7 kb，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子[3]。趙振華等[4]發(fā)現(xiàn)MSTN是雞肌肉生長(zhǎng)主效基因之一，基因突變顯著影響優(yōu)質(zhì)雞肌肉生長(zhǎng)。鄺良德等[5]研究表明，MSTN基因可能是家兔出生后生長(zhǎng)發(fā)育的主要候選基因，其表達(dá)水平與家兔體質(zhì)量差異有直接關(guān)系。由于該基因突變與缺失，在人[6]、牛[7-9]、羊[10]、豬[11]和狗這幾個(gè)物種上均有“雙肌性狀”表型的產(chǎn)生，關(guān)于雞[12]、牛[7]、羊[8]、豬[9]等畜禽MSTN基因的研究報(bào)道較多。兔MSTN基因cDNA由王林嵩等[13]克隆，有關(guān)家兔MSTN基因的研究主要集中在多態(tài)性方面，編碼蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能的研究尚未見報(bào)道。

本研究以大耳白兔為研究對(duì)象，構(gòu)建DNA混合池，利用PCR擴(kuò)增與直接測(cè)序技術(shù)對(duì)其MSTN基因進(jìn)行SNP篩查，尋找對(duì)物種生長(zhǎng)發(fā)育有利的SNP，然后將其運(yùn)用于后續(xù)育種實(shí)踐中[14-15]，并利用生物信息學(xué)方法從分子水平預(yù)測(cè)大耳白兔MSTN基因編碼蛋白的理化性質(zhì)與功能信息，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以期為深入研究MSTN基因及其編碼氨基酸的功能奠定基礎(chǔ)，也為大耳白兔生長(zhǎng)發(fā)育和肉質(zhì)性狀研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用醫(yī)用采血管采集日本大耳白兔血樣55份，-20 ℃冷凍保存。采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法進(jìn)行全基因組DNA提取[16]，去離子水溶解并稀釋，大耳白兔DNA稀釋液各取4 μL構(gòu)建DNA混合池，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中兔的MSTN基因序列(登錄號(hào)：NM_001109821，NP_001103291)，利用Primer 6.0設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物(表1)，分別擴(kuò)增MSTN基因3個(gè)外顯子和部分內(nèi)含子序列，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為20 μL，其中：模板DNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，TaqPCR MasterMix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 測(cè)序與SNPs位點(diǎn)篩查

所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后送杭州金唯智生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar、MegAlign和Editseq軟件進(jìn)行序列比對(duì)和拼接，獲得大耳白兔MSTN基因編碼區(qū)序列，與NM_001109821和NP_001103291進(jìn)行對(duì)比，從而確定SNP位點(diǎn)。

表1 MSTN基因引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析

大耳白兔MSTN基因CDS區(qū)生物信息學(xué)分析利用參考文獻(xiàn)[17]介紹的在線軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSTN基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰，特異性好，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致(圖1)。

2.2 SNPs位點(diǎn)篩查結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明，大耳白兔MSTN基因僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，位于Exon1的102 bp處，由T突變?yōu)镃(圖2)，命名為T102C。該位點(diǎn)位于編碼區(qū)外，因此該堿基突變并不影響編碼氨基酸序列的改變。

M,1 kb DNA marker；1～5, Exon1-Exon3各部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1, 5′UTR+Exon1；2, Exon1；3, Intron1+Exon2；4, Exon2；5, Intron2+Exon。M, 1 kb DNA marker; 1-5, PCR product of Exon1-Exon3; 1, 5′UTR+Exon1; 2, Exon1; 3, Intron1+Exon2; 4, Exon2; 5, Intron2+Exon.圖1 MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of MSTN

圖2 大耳白兔MSTN基因PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖及SNP位點(diǎn)Fig.2 PCR product of MSTN sequencing peak and SNP site in Japanese White Rabbit

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1MSTN基因編碼氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

大耳白兔MSTN基因CDS區(qū)由1 128個(gè)堿基對(duì)組成，共編碼375個(gè)氨基酸，各種氨基酸所占比例見圖3。其編碼蛋白分子式為C1913H3002N510O562S22，分子量為42.8 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為6.97，不穩(wěn)定系數(shù)為41.25，屬不穩(wěn)定蛋白類[18]，半衰期為30 h。氨基酸殘基中負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)與正電荷殘基總數(shù)相同均為47，亮氨酸(Leu)數(shù)目最多為32個(gè)，占全部氨基酸組成的8.5%，組氨酸(His)和色氨酸(Trp)數(shù)目最少為6個(gè)，所占比例為1.6%。

2.3.2 大耳白兔MSTN基因編碼氨基酸疏水性/親水性預(yù)測(cè)與分析

大耳白兔MSTN基因編碼氨基酸的親水性/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖4所示，第14位蛋氨酸(M)疏水性最強(qiáng)(最高分值2.889)；第28位谷氨酸(E)親水性最強(qiáng)(最低分值-3.244)。整條氨基酸肽鏈中親水氨基酸所占比例較多(65.12%)，且其總平均分值為-0.418 95，表現(xiàn)為親水性，因此預(yù)測(cè)此蛋白為可溶性蛋白。

2.3.3 大耳白兔MSTN基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

MSTN編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和伸展鏈組成(圖5)，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)占44.80%，伸展鏈(Ee)占25.60%，α-螺旋(Hh)和β-轉(zhuǎn)角(Tt)分別占21.87%與7.73%。根據(jù)α-螺旋比例小于45%且伸展鏈比例大于20%的原則[19]，判斷該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型。三級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖6)。

圖3 大耳白兔MSTN編碼蛋白的氨基酸組成預(yù)測(cè)Fig.3 Amino acid composition of MSTN encoding protein predicted in Japanese White Rabbit

正值表示疏水，負(fù)值表示親水。The positive value meant the hydrophobic，negative meant hydrophilic.圖4 MSTN基因編碼氨基酸疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of MSTN gene encoding amino acid

2.3.4 大耳白兔MSTN基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MegAlian軟件對(duì)大耳白兔、普通兔、黃牛、鼠等物種的MSTN基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建(圖7)。結(jié)果表明，大耳白兔與普通兔MSTN基因相似度為100%，與家貓具有較高同源性，與雞的同源性最低，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

3 討論

MSTN參與動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，該基因缺失會(huì)造成骨骼肌異常肥大[20]，MSTN突變的動(dòng)物骨骼肌肌群分布廣泛且肉質(zhì)優(yōu)良[21]，對(duì)其進(jìn)行單核苷酸突變篩選對(duì)繁育優(yōu)良肉質(zhì)品種有重要意義。通過(guò)對(duì)大耳白兔MSTN基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)MSTN基因CDS區(qū)由1 128個(gè)堿基對(duì)組成，共編碼375個(gè)氨基酸，有3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子。單核苷酸突變篩查發(fā)現(xiàn)，僅在Exon 1中存在一個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)T102C，這與張柯[22]的研究結(jié)果較為一致，然而此突變位點(diǎn)沒有位于編碼區(qū)，并沒有影響氨基酸序列發(fā)生改變，但是否對(duì)氨基酸的翻譯有調(diào)節(jié)作用還需進(jìn)一步探討研究。其編碼氨基酸殘基數(shù)與其他物種全部相同，且與普通家兔編碼氨基酸也相同，說(shuō)明普通家兔與大耳白兔MSTN基因不存在差異，MSTN基因在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守[23]。

h，α-螺旋；e，伸展鏈；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲。h, Alpha helix; e, Extended strand; t, Beta turn; c, Random coli.圖5 MSTN基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of MSTN gene encoding protein

圖6 MSTN編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of tertiary structure of MSTN encoded protein

研究表明，大耳白兔MSTN基因編碼蛋白不穩(wěn)定系數(shù)較高，屬不穩(wěn)定蛋白類。賈浩等[24]認(rèn)為，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與半衰期存在緊密聯(lián)系，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性低則半衰期短。本研究所得大耳白兔MSTN基因編碼蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.25(>40)，屬不穩(wěn)定蛋白類，但卻具有較長(zhǎng)半衰期(30 h)，與賈浩等[24]的結(jié)果不一致，這種結(jié)果可能是由于MSTN基因編碼蛋白的理化性質(zhì)與功能發(fā)揮之間沒有關(guān)系造成的。氨基酸的親疏水性與氨基酸的結(jié)構(gòu)和功能緊密相連，是氨基酸的固有特性，總平均分值可以體現(xiàn)蛋白質(zhì)的親疏水性質(zhì)，總平均分值越低，親水性越強(qiáng)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，整條氨基酸肽鏈中親水氨基酸所占比例為65.12%，且其總平均分值為-0.418 95，表現(xiàn)為親水性，因此預(yù)測(cè)此蛋白為可溶性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)很容易親水。編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果中Hh<45%、Ee>20%，因此推斷大耳白兔MSTN編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型，主要由無(wú)規(guī)則卷曲和伸展鏈組成，無(wú)規(guī)則卷曲占44.80%，伸展鏈占25.60%。無(wú)規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈影響而使空間構(gòu)象發(fā)生改變[25]，大量無(wú)規(guī)則卷曲容易改變蛋白質(zhì)構(gòu)象從而改變蛋白質(zhì)功能，此基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較大，為44.80%，因此其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能是否發(fā)生改變還需深入研究。三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)螺旋、折疊而形成的特定空間構(gòu)象，通過(guò)對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹在一定程度上反映了各物種間的同源性及親緣關(guān)系，對(duì)大耳白兔與家兔、黃牛、狗、馬、羊、等的MSTN基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，大耳白兔MSTN基因編碼氨基酸與普通家兔親緣關(guān)系高達(dá)100%，與普通家兔、家貓、豬、馬的相似度較高、親緣關(guān)系較近，與雞、羊、黃牛的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，符合物種進(jìn)化規(guī)律。