葛榮靖 倪虹 申林 王其一

摘 要：目的 探討發(fā)育過(guò)程中能障變化規(guī)律及對(duì)小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元編碼能力的影響。方法 取生后6-12天（未睜眼）、15-22天（睜眼）小鼠，孵育腦片并用膜片鉗記錄皮層GABA能神經(jīng)元電的生理特性。使用Clampfit10軟件記錄動(dòng)作電位的能障（potential barrier， PB）、動(dòng)作電位間距（inter-spike intervals， ISI），并分析結(jié)果。結(jié)果 發(fā)育過(guò)程中，小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元能障減?。≒<0.01）、ISI縮短（P<0.01）。 PB與ISI之間始終呈線性相關(guān)。結(jié)論 小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元在生后發(fā)育過(guò)程中，發(fā)放動(dòng)作電位的能障逐漸降低，神經(jīng)元編碼能力上調(diào)。

關(guān)鍵詞：發(fā)育；GABA能神經(jīng)元；能障；全細(xì)胞記錄

γ-氨基丁酸（GABA）是腦皮質(zhì)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由GABA能神經(jīng)元合成并分泌，分布于大腦皮質(zhì)各個(gè)區(qū)域[1]。GABA能神經(jīng)的活動(dòng)對(duì)腦功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。在一些研究中，通過(guò)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粎?shù)的量化分析來(lái)研究其編碼特性，如動(dòng)作電位間距（inter-spike intervals，ISI），絕對(duì)不應(yīng)期（absolute refractory period， ARP）、能障（potential barrier， PB）等[2，3，4，5]。本課題組之前研究了小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢辉谏蟀l(fā)育過(guò)程中的變化規(guī)律[6]：在發(fā)育過(guò)程中，皮層GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏腎SI縮短，ARP的縮短是重要的影響因素。這些變化使GABA能神經(jīng)元的興奮性逐漸增加。

本研究將對(duì)皮層GABA能神經(jīng)元興奮性發(fā)育做進(jìn)一步探索。通過(guò)改變?nèi)O化刺激強(qiáng)度（閾刺激強(qiáng)度×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25）誘發(fā)動(dòng)作電位，通過(guò)預(yù)設(shè)刺激模式，當(dāng)前一個(gè)動(dòng)作電位產(chǎn)生并完全恢復(fù)后再施加與前次相等的去極化電流刺激，以此產(chǎn)生5組動(dòng)作電位，分別各采樣20次，獲得5組連續(xù)動(dòng)作電位群組，采用全細(xì)胞記錄方法，探討小鼠發(fā)育過(guò)程中內(nèi)在特性的變化及對(duì)動(dòng)作電位編碼的影響，為GABA能神經(jīng)元發(fā)育的機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法[7]

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)用液組成

1.1.1藥品：

Hepes（Sigma）；Mg2ATP（Sigma）；EGTA（Sigma）；Tris2GTP（Sigma）；Kclu（Sigma）；42Na2phosphocreatine（Sigma）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：

蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供轉(zhuǎn)基因FVB-Tg（Gad GFP）45704 Swn/J小鼠，使用許可證【SYXK（皖2012-002）】。

1.1.3人工腦脊液（mmol/L）

3 KCl， 124 NaCl， 26 NaHCO3， 1.3NaH2PO4， 5 HEPES， 10 dextrose， 0.5 CaCl2和4 MgSO4 （95%O2和5%CO2充分氧合）。

1.1.4 電極標(biāo)準(zhǔn)液（mmol/L）

4 NaCl， 150 葡萄糖酸鉀， 0.5 EGTA， 10 HEPES， 1 Tris-GTP， 4 Mg2+-ATP （pH調(diào)至7.35；滲透壓295～305 mOsmol）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

選用生后6-12天、15-22天的FVB-Tg（Gad GFP）45704 Swn/J小鼠，剪刀斷頭，快速剝離大腦，轉(zhuǎn)移至充分氧合的人工腦脊液，用振蕩切片機(jī)制作腦片標(biāo)本約3-5片（400μm）。將腦片移至裝有充分氧合的人工腦脊液的培養(yǎng)皿中，保持環(huán)境溫度約35℃，孵育1小時(shí)[5]。 隨后將腦片轉(zhuǎn)移至IR-DIC光學(xué)顯微鏡下的記錄槽中，小槽內(nèi)預(yù)先充灌35？C氧合的人工腦脊液，灌流速度約為40-50滴/分。通過(guò)全細(xì)胞記錄[5]（Axoclamp-2B 放大器，電流鉗模式，3 kHz高頻濾波），pClamp 10記錄信號(hào)并進(jìn)行分析。

通過(guò)Clampfit10軟件設(shè)定刺激脈沖：5 ms去極化電流，逐步增加電流強(qiáng)度，至50%可能性產(chǎn)生動(dòng)作電位時(shí)，此電流值設(shè)為閾刺激。在閾刺激基礎(chǔ)上，改變?nèi)O化電流強(qiáng)度（閾刺激強(qiáng)度×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25）誘發(fā)動(dòng)作電位。為了使閾刺激強(qiáng)度×0.7， ×0.85組可以正常誘發(fā)動(dòng)作電位，故將閾強(qiáng)度預(yù)設(shè)為閾刺激強(qiáng)度×0.7組的刺激強(qiáng)度，反推出其他組刺激強(qiáng)度，獲得相應(yīng)的動(dòng)作電位波形，應(yīng)用Clampfit分別對(duì)動(dòng)作電位參數(shù)（PB、ISI值）進(jìn)行測(cè)定（測(cè)量方法見(jiàn)后文述）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

小鼠出生后6-12天由于眼睛未振凱，設(shè)為未睜眼組；15-22天眼睛睜開(kāi)，設(shè)為睜眼組[6]。

1.4PB和ISI的測(cè)定

能障（potential barrier， PB）：分別測(cè)得閾電位（threshold potential， Vts）及靜息電位（resting membrane potential， Vr ），其差值即為PB[2]。[圖1（A）]。

動(dòng)作電位間距（ISI）：為相鄰兩動(dòng)作電位峰值間的距離，其值與神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的容量成反比。[圖1（B）]

1.5控制指標(biāo)

在獲得的數(shù)據(jù)中，只選用靜息電位低于-65 mV的記錄納入統(tǒng)計(jì)分析。靜息膜電位、動(dòng)作電位幅度和輸入阻抗的波動(dòng)范圍在5%之內(nèi)[8]。保持電極阻抗為5-6 M。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（ ±SE）表示，SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)， P <0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2、結(jié)果

2.1 GABA能神經(jīng)元能障在發(fā)育中的變化

小鼠睜眼前后分別記錄大腦皮層GABA能神經(jīng)元的序列動(dòng)作電位。結(jié)果顯示，不同強(qiáng)度去極化脈沖所誘發(fā)的GABA能神經(jīng)元的序列動(dòng)作電位的PB在兩組間均存在顯著差異（P<0.01）。給予不同強(qiáng)度的刺激，睜眼組產(chǎn)生動(dòng)作電位的PB均較未睜眼組減小[圖2]。

（A）在大腦皮層GABA能神經(jīng)元測(cè)量能障的方法。測(cè)量閾電位（threshold potential， Vts）和靜息電位（resting potential，Vr ），其差值即為PB[2]；（B）動(dòng)作電位間距（ISI）的測(cè)量方法。向細(xì)胞內(nèi)輸入電流刺激神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，測(cè)量相鄰動(dòng)作電位峰值間的時(shí)間差 [6]。

在STi×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25四種電流刺激強(qiáng)度下，睜眼組較未睜眼組Vts-Vr1、Vts-Vr2、Vts-Vr3、Vts-Vr4、Vts-Vr5均減小。*P<0.01，睜眼組與未睜眼組比較。

2.2 發(fā)育對(duì)GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚g距（ISI） 的影響

小鼠發(fā)育中，分別對(duì)睜眼前及睜眼后小鼠進(jìn)行電生理記錄。隨著刺激強(qiáng)度變化，大腦皮層GABA能神經(jīng)元發(fā)放的動(dòng)作電位對(duì)應(yīng)的ISI存在差異性，睜眼組較未睜眼組ISI縮短（P<0.01）。（圖3）：

2.3.發(fā)育中能障（PB）與動(dòng)作電位間距（ISI）之間的關(guān)系

量化內(nèi)在特性和動(dòng)作電位編碼間關(guān)系。未睜眼組PB和ISI之間具有線性先關(guān)。四組刺激中相關(guān)系數(shù)分別為：sti×0.7（r2=0.92），sti×0.85（r2=0.96）， sti×1（r2=0.81），sti×1.25（r2=0.78）。睜眼組的PB和ISI之間也具有線性相關(guān)。四組刺激中相關(guān)系數(shù)分別為：sti×0.7（r2=0.91），sti×0.85 （r2=0.99），sti×1 （r2=0.92，P），sti×1.25 （r2=0.92）。（圖4）

在STi×0.7， ×0.85， ×1， ×1.25四種電流刺激強(qiáng)度下，可見(jiàn)睜眼組較未睜眼組ISI1、ISI2、ISI3、ISI4均縮短。*P<0.01，睜眼組與未睜眼組比較。

（A）未睜眼組，不同刺激強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位的PB與ISI之間線性相關(guān)。（B）睜眼組，不同刺激強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位的PB與ISI之間線性相關(guān)。

討論：

GABA是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要意義。神經(jīng)精神性疾病多與GABA能神經(jīng)元活動(dòng)異常有關(guān)[9，10，11]。本研究對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膬?nèi)在特性及編碼模式進(jìn)行研究，探討小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元的發(fā)育規(guī)律。

本實(shí)驗(yàn)中量化研究了不同發(fā)育階段、不同刺激強(qiáng)度下的小鼠GABA能神經(jīng)元的能障（PB）、動(dòng)作電位間距（ISI）。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育過(guò)程中動(dòng)作電位參數(shù)均呈動(dòng)態(tài)變化，主要表現(xiàn)在①發(fā)育過(guò)程中，GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏哪苷峡s短，意味著靜息電位水平或最大復(fù)極電位水平與閾電位水平之間的差距減小，神經(jīng)元興奮性增加。能障主要反映了GABA能神經(jīng)元神經(jīng)元閾電位水平，實(shí)質(zhì)是Na+通道電壓依賴性的變化。能障減小，閾電位水平下移可使神經(jīng)元興奮性增加。②發(fā)育中ISI縮短意味著單位時(shí)間內(nèi)發(fā)放的動(dòng)作電位個(gè)數(shù)增加，是GABA能神經(jīng)元興奮性增加的結(jié)果，提示動(dòng)作單位的編碼能力上調(diào)。編碼能力上調(diào)是情緒、學(xué)習(xí)、記憶等行為的神經(jīng)信號(hào)基礎(chǔ)，也是動(dòng)作電位的編碼重要形式[12-13]。③未睜眼組與睜眼組中，能障（PB）始終與ISI之間存在線性相關(guān)，提示這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的控制過(guò)程。PB通過(guò)什么機(jī)制調(diào)控ISI仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

綜上，在發(fā)育過(guò)程中GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏哪苷希≒B）降低，使GABA能神經(jīng)元興奮性增加；GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚g距增加，使神經(jīng)元在單位時(shí)間內(nèi)發(fā)放動(dòng)作電位的個(gè)數(shù)增加編碼信號(hào)的能力增強(qiáng)。本研究進(jìn)一步探討了小鼠大腦皮層GABA能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)育規(guī)律，明確了能障與ISI之間的關(guān)系，為了解GABA能神經(jīng)元對(duì)輸入信息的編碼機(jī)制及發(fā)育規(guī)律提供一些理論依據(jù)。

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作者簡(jiǎn)介：

葛榮靖（1982-），女，安徽省蚌埠市人，民 族：漢 職稱：講師，學(xué)歷：博士研究生。研究方向：神經(jīng)信息編碼的細(xì)胞與分子機(jī)制。

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（1608085QH176）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012B105）；蚌埠醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（BYKY1623ZD）.