馬小芳，楊世龍，唐 穎，周夢怡

(南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，江蘇南京 210037)

銀杏葉中含有豐富的營養(yǎng)成分，主要含有黃酮類、內(nèi)酯類、多糖類、兒茶素類、聚異戊烯醇、烷基酚及酚酸類、原花青素類、氨基酸類、維生素、脂肪類、有機(jī)酸類和微量元素等200多種化合物。銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaf，EGb)是采用一定的工藝將銀杏葉中銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯等主要活性成分提取出來的產(chǎn)品，具有多種生物活性，應(yīng)用廣泛。由于銀杏葉中黃酮類化合物含量較高、活性較好，因此，有關(guān)黃酮類化合物的研究方興未艾。銀杏黃酮類包括銀杏單黃酮和銀杏雙黃酮，它們都具有許多生物活性，但由于銀杏雙黃酮在銀杏葉中含量較低，研究較困難，所以研究相對較少，但其應(yīng)用前景較好。

銀杏雙黃酮是由兩分子黃酮母核通過C－C鍵聚合而成的一類化合物，主要有6種，分別為穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮、銀杏黃素、異銀杏黃素、白果黃素，5＇－甲氧基白果黃素。主要雙黃酮類化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 主要銀杏雙黃酮結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of biflavonoids in ginkgo leaves

1 銀杏雙黃酮類化合物的提取與純化

早在1929年，F(xiàn)urukawa就從銀杏葉中提取分離得到了雙黃酮類化合物，但由于科技水平限制，直到1941中澤浩一分離出了銀杏黃素，并確定了它的分子式為C32H22O10［1］。到 20 世紀(jì)60年代，隨著現(xiàn)代分離分析技術(shù)的發(fā)展，使人們對銀杏葉的基本成分有了新的更深入的認(rèn)識。BarKer等人［2］又用萃取、重結(jié)晶、逆流分離等方法，從銀杏黃素的混合物內(nèi)分離出異銀杏黃素和白果黃素兩種雙黃酮。1969年 Miura等人［3］從銀杏葉中首次分離得到金松雙黃酮，1980年，Marc等人［4］從銀杏葉中首次提取得到了5＇－甲氧基白果黃素，1988年，Lobstein等人［5］首次在銀杏葉中得到了穗花杉雙黃酮，1999年，Krauze等人［6］從銀杏葉中分離得到了2，3－二氫金松雙黃酮，2005年，Hyun等人［7］還從銀杏葉中提取得到了銀杏黃素和異銀杏黃素的糖苷。我國對銀杏葉中雙黃酮的研究較晚，1983年，周日秀［8］對廬山銀杏葉中的雙黃酮進(jìn)行分離鑒定，得到金松雙黃酮和異銀杏雙黃酮。1991年，游松等［9］對銀杏葉中的雙黃酮進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析;1995年鐘郁青等［10］分離得到銀杏黃素、異銀杏黃素和去甲基銀杏黃素，并采用內(nèi)標(biāo)法測定其含量;1999年，王曉葵［11］發(fā)現(xiàn)用乙二醇二甲醚提取銀杏葉，提取液中的雙黃酮含量較高，效果比乙醇、甲醇和乙醇－乙醚(1∶1)好，而用乙醇－乙二醇二甲醚(1∶1)混合提取銀杏葉，提取液中雙黃酮含量更高，所得提取物中銀杏雙黃酮的含量達(dá)53.89%;2001年唐于平等［12］從銀杏葉中分離得到銀杏黃素、異銀杏黃素和金松雙黃酮;2006年尉小慧等［13］從銀杏葉中分離得到了銀杏黃素、去甲基銀杏黃素和金松雙黃酮，并研究了其對磷酸二酯酶5抑制活活性;2010年，孔繁晟等［14］從銀杏葉中制備的金松雙黃酮可以作為對照品，得到純度為98.5%金松雙黃酮。2012年姚鑫等［15］分析了銀杏落葉的化學(xué)成分，經(jīng)提取、萃取、過柱得到銀杏黃素、異銀杏黃素、金松雙黃酮和白果黃素。

提取銀杏葉中雙黃酮的主要方法是溶劑回流法，所得提取液中往往成分復(fù)雜，含有單黃酮、黃酮苷、糖類、鞣質(zhì)、酸類等多種成分，需要進(jìn)一步分離純化，需經(jīng)萃取、過柱、重結(jié)晶等分離純化方法得到不同雙黃酮的單體。

1.1 提取溶劑的選擇

與單黃酮和黃酮苷相比，雙黃酮類化合物極性較小，采用極性相對較小的溶劑可以提高雙黃酮的提取率。目前常用于提取雙黃酮的溶劑有95%乙醇、乙醇、甲醇、60%丙酮、丙酮、乙醚、氯仿、乙醇－乙二醇二甲醚(1:1)混合溶劑等。采用加熱、超聲、微波等輔助方法，以此來提高雙黃酮的提取率;采用索式提取等方法可以減少后處理操作，提高效率。

1.2 分離純化

常用來分離純化雙黃酮類化合物的方法有萃取、柱色譜、重結(jié)晶等方法，隨著科技的發(fā)展，高效逆流分配色譜、制備液相等儀器的出現(xiàn)大大提高了分離效果和工作效率。根據(jù)相似相容原理，雙黃酮類化合物易溶于極性較低的化合物，如乙酸乙酯、氯仿等;同時，雙黃酮類含有酚羥基，也易溶于堿性水溶液中，因此，可以采用不同極性的有機(jī)溶劑、不同pH的堿性溶液作為萃取劑、洗脫劑或重結(jié)晶溶劑，將不同種類的化合物分離，從而得到雙黃酮類化合物。例如，Miura等人［3］將銀杏葉的甲醇提取液旋干，得到甲醇粗體物，先用熱水除去粗體物中水溶性成分，剩下的粗提物用三氯乙烯回流，收集不溶固體，用3%KOH溶液溶解，過濾，酸化，得到的沉淀用50%乙醇溶解，將不容固體乙酰化，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到的晶體用2.5%KOH水解，吡啶－甲醇重結(jié)晶，得到雙黃酮混合物，采用逆流分配法得到白果黃素、銀杏黃素、異銀杏黃素和金松雙黃酮。

由上可以看出，銀杏葉中雙黃酮的提取步驟較為繁瑣，但基本操作包括:先采用醇、酮、乙醚等提取，將提取液用堿性水溶液或有機(jī)溶劑萃取，將乙酸乙酯或氯仿萃取部分上硅膠柱，采用不同極性的溶劑洗脫，得到雙黃酮粗體物，經(jīng)重結(jié)晶得到雙黃酮化合物單體。

2 銀杏雙黃酮類化合物的生物活性

雙黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。

2.1 抗腫瘤活性

Pan等［16］從分子結(jié)構(gòu)上研究了穗花杉類雙黃酮與組織蛋白酶B相互作用，進(jìn)一步揭示了雙黃酮抑制組織蛋白酶B的機(jī)理，有利于進(jìn)一步了解雙黃酮抗炎、抗腫瘤的機(jī)理。研究研究發(fā)現(xiàn)銀杏黃素具有抑制卵巢癌的作用，其IC50值為1.8μg·mL－1。穗花杉雙黃酮通過激活hPPARγ來提高抗癌基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的效果［17－18］。Sang等［19］研究發(fā)現(xiàn)異銀杏黃素通過抑制HT1080纖維肉瘤細(xì)胞中的MMP－9表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的增殖。

2.2 抗氧化活性

潘蘇華等［20］研究發(fā)現(xiàn)異銀杏雙黃酮使缺氧大鼠血漿及紅細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量降低，其作用優(yōu)于阿司匹林;此外異銀杏雙黃酮能使血清總超氧化物歧化酶(SOD)活性升高。Lee等［21］研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可以抑制由紫外輻射引起的金屬蛋白酶的表達(dá)，從而起到抗氧化、防輻射的作用。Zhang等［22］研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮和銀杏黃素具有一定的抗氧化活性，去除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。Li等研究表明［23］，穗花杉雙黃酮具有抗氧化活性，可有效清除·OH，·O2－，DPPH·，ABTS+·等自由基，并可以保護(hù)DNA免受·OH引起的氧化損傷。

2.3 抗炎活性

銀杏雙黃酮類化合物通過抑制磷脂酶A2、促炎基因的表達(dá)起到抗炎的作用。Hyun等［24］通過對小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)銀杏黃素能抑制慢性皮炎，還能抑制表皮增生。Son等［25］研究發(fā)現(xiàn)，銀杏黃素通過抑制小鼠骨髓中的環(huán)氧合酶－2和5－脂氧合酶來達(dá)到治療關(guān)節(jié)炎的效果，其IC50值為分別為0.75μmol·L－1和 0.33μmol·L－1，同時，銀杏黃素還能抑制細(xì)胞脫粒反應(yīng)，其IC50值為6.52μmol·L－1。Zhou 等［26］采用 SEAP 實(shí)驗(yàn)法得到銀杏黃素和異銀杏黃素能抑制NF－κB因子，從而起到抗炎的作用，且銀杏黃素的抑制作用強(qiáng)于異銀杏黃素，其IC50值為7.5 μmol·L－1。An等［27］的研究表明，穗花杉雙黃酮具有較好的抗炎效果，可以有效抑制因牛皮癬引起的皮膚褶皺增厚和紅疹，其機(jī)理是穗花杉雙黃酮通過影響一系列激素而起到抗炎的作用，可以作為治療牛皮癬的藥物。

2.4 抗病毒活性

Lin等［28］體外研究表明穗花杉雙黃酮可以抑制HIV－1病毒，IC50值為119μmol·L－1。Wilsky 等［29］研究表明，穗花杉雙黃酮通過抑制脂肪酸合酶來降低柯薩奇病毒B3的增殖。Ryu等［30］研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮具有較強(qiáng)抑制SARS－CoV3CLpro病毒活性，IC50 值為 8.3μmol·L－1。

2.5 滅菌殺蟲活性

Hwang等［31］研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能引起白色念珠菌線粒體紊亂，引起細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑菌的效果。Weniger等人［32］研究發(fā)現(xiàn)銀杏黃素和異銀杏黃素具有殺滅錐體蟲的活性，IC50值分別為11，13μmol·L－1，此外異銀杏黃素對殺滅利什曼原蟲具有較高的活性，其 IC50值為 1.9μmol·L－1。

2.6 生理調(diào)節(jié)作用

Saponara等［33］研究發(fā)現(xiàn)，雙黃酮類化合物可以抑制cAMP－磷酸二酯酶，其抑制順序?yàn)?穗花杉雙黃酮＞白果黃素＞紅杉黃酮＞銀杏黃素=異銀杏黃素，而金松雙黃酮幾乎沒有抑制作用。von Moltke等［34］的研究結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮可有效抑制細(xì)胞色素 P450家族中的 CYP2C9，IC50值為0.019μg·mL－1(0.035 μmol·L－1)。Lee等［35］研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮是過氧化物酶體增殖劑激活受(hPPARγ)激活劑，可以通過調(diào)節(jié)hPPARγ來調(diào)節(jié)生物體的新陳代謝，并研究了穗花杉雙黃酮和hPPARγ的結(jié)合模型。

2.7 抑制心腦血管疾病

雙黃酮化合物具有調(diào)節(jié)血糖血脂，防止血栓形成的作用，對中風(fēng)老年癡呆有一定活性。潘蘇華等［36］研究證明，異銀杏雙黃酮體內(nèi)給藥，可以抑制腺苷二磷酸(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集，血漿纖維蛋白原含量明顯降低。體外實(shí)驗(yàn)表明，異銀杏雙黃酮對ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集均有抑制作用，也能抑制膠原誘導(dǎo)的血小板變形和減慢血小板最大聚集速度，因此異銀杏雙黃酮具有抑制血小板聚集、防止血栓形成的作用。Arjun Thapa等［37］研究表明穗花杉雙黃酮可以阻止β－淀粉狀蛋白聚合，防止老年癡呆癥的發(fā)生，且雙黃酮類化合物的活性強(qiáng)于單黃酮。

2.8 其他作用

此外雙黃酮化合物還具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)骨骼發(fā)育等作用。Kang等［38］研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮、銀杏黃素和異銀杏黃素對氧化和β－淀粉狀蛋白引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有較強(qiáng)的抑制作用，起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，具有治療中風(fēng)、老年癡呆等神經(jīng)疾病的潛力。Ishola等［39］研究表明穗花杉雙黃酮具有抗抑郁、抗焦慮的作用，可改善小鼠的精神狀態(tài)。Lee等［40］通過研究小鼠骨細(xì)胞中堿性磷酸酶活性、膠原合成和礦化程度發(fā)現(xiàn)白果黃素和金松雙黃酮具有促進(jìn)骨細(xì)胞分化的作用，有望應(yīng)用于治療相關(guān)骨骼疾病。Prasad等［41］發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮具有在體內(nèi)降低油脂的活性，有望用來治療高血脂等由脂肪過多引起的疾病。

3 展望

銀杏雙黃酮類化合物具有多種生物活性，且部分生物活性強(qiáng)于單黃酮，是一類具有開發(fā)應(yīng)用前景的化合物。雙黃酮類化合物在天然產(chǎn)物中來源少，開展雙黃酮類化合物的全合成工作很有意義;此外可以對天然雙黃酮類化合物進(jìn)行改性，以提高其生物活性，更好的應(yīng)用于醫(yī)療保健。研究銀杏雙黃酮不僅進(jìn)一步利用銀杏葉資源，更可以造福于人類。