趙進(jìn)軍,黃 琴,任 昊,歐陽晴晴,毋 靜,楊 敏△

(南方醫(yī)科大學(xué)：1.南方醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；2.珠江醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣州 510515)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至少有8種類型細(xì)胞參與，包括肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞[1]、B細(xì)胞[2]、樹突狀細(xì)胞[3]、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。在正?；ぶ蟹蚀蠹?xì)胞約占滑膜表面細(xì)胞的3%；而在RA患者滑膜中肥大細(xì)胞數(shù)量可占到滑膜表面細(xì)胞的5%，說明肥大細(xì)胞在RA疾病中起重要作用[4]。RA的主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。因此，針對RA的治療，除控制炎癥外，就是尋求保護(hù)軟骨的方法。軟骨基質(zhì)主要由Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ膠原組成，其中Ⅱ型膠原(CⅡ)的半衰期最長[5]。本研究將肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，以期發(fā)現(xiàn)對軟骨細(xì)胞分泌CⅡ影響最大的細(xì)胞類型。由于肥大細(xì)胞可分泌多種蛋白酶，本研究擬通過肥大細(xì)胞的穩(wěn)定劑、激活劑和酶抑制劑，以期發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶S是否對CⅡ的破壞存在作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為8～9周齡C57BL/6雌性小鼠，在SPF級動(dòng)物所飼養(yǎng)，符合南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例，用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)進(jìn)行造模，造模成功后進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自Gibco公司；Ⅳ型膠原酶，色甘酸二鈉(DSCG)，肥大細(xì)胞的激活劑(C48/80)，脂多糖(LPS)購自Sigma公司；Anti-Cathepsin S抗體、Anti-Collagen Ⅱ抗體，GAPDH抗體購自Abcam公司；組織蛋白酶S的ELISA試劑盒購自LifeSpan公司；CⅡ ELISA試劑盒購自武漢華美；Transwell培養(yǎng)板購自Corning；其余均為國產(chǎn)分析純。LHVS由哈佛大學(xué)的施國平教授贈(zèng)送。

1.2 方法

1.2.14種原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

滑膜成纖維細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)使用0.3%的Ⅳ型膠原酶消化法。腹腔巨噬細(xì)胞使用3%的Thioglycollate肉湯。骨髓源性肥大細(xì)胞的原代培養(yǎng)使用終濃度為10 g/mL的重組小鼠IL-3和SCF刺激。

1.2.2軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)分4組：軟骨細(xì)胞對照組、軟骨細(xì)胞+滑膜成纖維細(xì)胞組、軟骨細(xì)胞+滑膜成纖維細(xì)胞+TNF-α低劑量刺激組(終濃度10 μg/mL)、軟骨細(xì)胞+滑膜成纖維細(xì)胞+TNF-α高劑量(終濃度100 μg/mL)刺激組。選取Transwell小室12孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞按3×105/mL濃度加入Transwell小室，共培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.3軟骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)分4組：軟骨細(xì)胞對照組、軟骨細(xì)胞+巨噬細(xì)胞激活組(LPS的終濃度為100 ng/mL)、軟骨細(xì)胞+巨噬細(xì)胞+LHVS(終濃度10 ng/mL)組、軟骨細(xì)胞+巨噬細(xì)胞+E64(終濃度20 μmol/L)組。巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分別按2×106/mL和3×105/mL濃度加入Transwell小室的內(nèi)孔，其中巨噬細(xì)胞的激活使用LPS(終濃度100 ng/mL)，共培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.4軟骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)分6組：軟骨細(xì)胞對照組、軟骨細(xì)胞+肥大細(xì)胞共培養(yǎng)對照組、軟骨細(xì)胞+肥大細(xì)胞+DSCG(終濃度10 μmol/L)組、軟骨細(xì)胞+肥大細(xì)胞+C48/80(終濃度5 μg/mL)組、軟骨細(xì)胞+肥大細(xì)胞+LHVS組、軟骨細(xì)胞+肥大細(xì)胞+E64組。肥大細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分別按1×106/mL和3×105/mL濃度加入12孔板，共培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.5ELISA檢測培養(yǎng)上清液中組織蛋白酶S和CⅡ的表達(dá) 培養(yǎng)上清液中組織蛋白酶S和CⅡ的ELISA檢測方法按試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品檢測3次。

1.2.6RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中CⅡ mRNA RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中CⅡ mRNA：提取總RNA，檢測總RNA的完整性，去除DNA，加入PCR引物(CⅡA1：5′-CCT GTT CTG AGA GGT CTT CCT G，5′-AAT ACC AGC AGC TCC CCT CT，GAPDH：5′-AGA AGG TGG TGA AGC AGG CAT C，5′-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AGT T)，反應(yīng)后每一個(gè)樣品目的基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(Ct)都依據(jù)GAPDH做校正。

1.2.7Western blot檢測組織蛋白酶S的表達(dá) 用lysis buffer冰上裂解細(xì)胞，獲得總蛋白，常規(guī)方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體、顯色等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的表達(dá)

小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)用TNF-α刺激時(shí)，CⅡ表達(dá)的結(jié)果見圖1A，各組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。軟骨細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ表達(dá)的結(jié)果見圖1C，軟骨+巨噬細(xì)胞激活組與其他組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑后，LHVS和E64組CⅡ的表達(dá)均升高，與軟骨細(xì)胞對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。軟骨細(xì)胞和骨髓源性肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ表達(dá)的結(jié)果見圖1E，軟骨+肥大+C48/80組與其他各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在加入組織蛋白酶S的抑制劑后，CⅡ的表達(dá)恢復(fù)正常。

2.2 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)組織蛋白酶S的表達(dá)

軟骨細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)組織蛋白酶S表達(dá)的結(jié)果見圖1G，軟骨+巨噬細(xì)胞激活組與其他組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑后，LHVS和E64組內(nèi)組織蛋白酶S的表達(dá)均降低。軟骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)組織蛋白酶S表達(dá)的結(jié)果見圖1H，軟骨+巨噬細(xì)胞激活組與其他各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，加用組織蛋白酶S的抑制劑LHVS和E64后，組織蛋白酶S表達(dá)降低，與軟骨+肥大對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：小鼠軟骨細(xì)胞與滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的ELISA結(jié)果；B：小鼠軟骨細(xì)胞與滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的RT-PCR結(jié)果；C：小鼠軟骨細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的ELISA結(jié)果；D：小鼠軟骨細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的RT-PCR結(jié)果；E：小鼠軟骨細(xì)胞與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的ELISA結(jié)果；F：小鼠軟骨細(xì)胞與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CⅡ的RT-PCR結(jié)果；G：巨噬細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)組織蛋白酶S的ELISA結(jié)果；H：肥大細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)組織蛋白酶S的ELISA結(jié)果；a:P<0.05;1：軟骨；2：軟骨+滑膜；3：軟骨+滑膜+TNF低；4：軟骨+滑膜+TNF高；5：軟骨；6：軟骨+巨噬；7：軟骨+巨噬+LHVS；8：軟骨+巨噬+E64；9：軟骨；10：軟骨+肥大；11：軟骨+肥大+DSCG；12：軟骨+肥大+C48/80；13：軟骨+肥大+LHVS；14：軟骨+肥大+E64

圖1細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果

2.3 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)RT-PCR結(jié)果

本研究對軟骨細(xì)胞和其他3種類型的細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行了CⅡ的RT-PCR檢測，不管是和滑膜成纖維細(xì)胞(圖1B)，腹腔巨噬細(xì)胞(圖1D)，還是和骨髓源性肥大細(xì)胞(圖1F)，各組間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：軟骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果；B：軟骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果

圖2組織蛋白酶S的Western blot結(jié)果

2.4 Western blot結(jié)果

本研究對軟骨細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)、軟骨細(xì)胞和骨髓源性肥大細(xì)胞共培養(yǎng)，提取總蛋白，Western blot結(jié)果見圖2。巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞分別被LPS和C48/80激活后，組織蛋白酶S的表達(dá)升高，而用組織蛋白酶S的抑制劑LHVS和E64可以抑制其表達(dá)。

3 討 論

組織蛋白酶S是一種屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶，在抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APCs)上高度表達(dá)，它對多種蛋白具有催化水解活性，特別是MHC Ⅱ恒定鏈(invariant chain，Ii)和細(xì)胞外基質(zhì)成分(彈性蛋白和膠原)。已證實(shí)組織蛋白酶S參與多種疾病，如阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病、腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛和多種自身免疫性疾病[6-7]等。但目前對組織蛋白酶S在RA中的作用研究較少[8]。

組織蛋白酶 S的底物廣泛[9]，最引起人們興趣的是它的高彈性蛋白水解活性[10]。但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中可能無關(guān)彈性蛋白的降解，因?yàn)樵诠呛蛙浌堑募?xì)胞外基質(zhì)中彈性蛋白水平極低。但組織蛋白酶 S有潛在的蛋白聚糖降解活性，特別是在中性和酸性pH中具有強(qiáng)大的水解軟骨聚集蛋白聚糖能力[11]。組織蛋白酶 S在RA關(guān)節(jié)的滑膜巨噬細(xì)胞上表達(dá)，在炎性過程中分泌蛋白酶入軟骨基質(zhì)，可能會破壞形成功能性軟骨的軟骨聚集蛋白聚糖-CⅡ網(wǎng)狀組織的完整性[12]。但目前很少有人研究組織蛋白酶S對軟骨細(xì)胞分泌CⅡ的影響[13]。

本研究共進(jìn)行了4種原代細(xì)胞的培養(yǎng)，包括小鼠滑膜成纖維細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和骨髓源性肥大細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在與滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，軟骨細(xì)胞分泌CⅡ的量無變化。而軟骨細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，及軟骨細(xì)胞與肥大細(xì)胞的共培養(yǎng)時(shí)，均發(fā)現(xiàn)CⅡ的量減少，尤其是在肥大細(xì)胞被其激活劑(C48/80)激活后。該研究證實(shí)巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞是組織蛋白酶S的主要來源，本研究在該研究中當(dāng)加入組織蛋白酶S的特異性抑制劑(LHVS)及非特異性抑制劑(E64)后，CⅡ的量恢復(fù)到正常水平，說明組織蛋白酶S可能是CⅡ量減少的主要因素。但細(xì)胞培養(yǎng)上清中CⅡ量減少是由于分泌減少還是分泌后被破壞需深一步研究。隨后收集各組軟骨細(xì)胞，裂解提取RNA后進(jìn)行CⅡ的RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)各組間RT-PCR水平相似，說明CⅡ在轉(zhuǎn)錄水平上未發(fā)生變化，因此認(rèn)為CⅡ主要是在合成后受到破壞。當(dāng)然，本研究中還存在不足，即未對組織蛋白酶S的活性進(jìn)行檢測，不能反映組織蛋白酶S在病變中的功能變化，這將是下一步研究的重點(diǎn)。

從本研究上看，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞均對軟骨細(xì)胞分泌CⅡ的影響較大，他們可能是影響軟骨功能的主要細(xì)胞類型，而在抑制了組織蛋白酶S功能后，CⅡ的分泌量恢復(fù)正常，說明組織蛋白酶S很有可能是CⅡ破壞的主要因素，因此針對組織蛋白酶S的特異性治療有可能是未來研究的方向。