譚 韜，劉應(yīng)杰，唐 倩，鐘文武，蘭作平

(1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 401331；2.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心 401331)

有報(bào)道表明，我國(guó)地表水中測(cè)出了60余種抗生素[1]，其濃度水平與檢出頻率均高于其他國(guó)家。殘留抗生素源于生活污水、畜牧養(yǎng)殖廢水及糞渣[2]、制藥廠[3]和醫(yī)院廢水[4-5]的排放，使得水環(huán)境維持低水平抗生素，對(duì)水生生物造成遠(yuǎn)期毒性作用，并使水中微生物群落產(chǎn)生耐藥性[6]。自然水體中殘留抗生素多為“ng/L”至“μg/L”級(jí)別[7]計(jì)算，常用固相萃取-高效液相色譜法(SPE-HPLC)[8]、固相萃取-高效相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(SPE-HPLC-MS/MS)[9]等方案進(jìn)行富集、分離，但存在預(yù)處理耗時(shí)、昂貴等問題。雖毛細(xì)管電泳在靈敏度和重現(xiàn)性略輸于HPLC[10]，但因其具備抗樣品基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于抗生素的分離檢測(cè)[11-13]。有報(bào)道稱，中國(guó)地表水環(huán)境中抗生素檢出頻率較多的種類有磺胺類(SAs)、喹諾酮類(FQs)、四環(huán)素類(TCs)等[1]，因此，建立一種同時(shí)對(duì)自然水體中多類殘留抗生素的分離檢測(cè)方案，對(duì)于殘留抗生素的快速、全面監(jiān)控顯得十分必要。

本研究經(jīng)綜合對(duì)比后,采用了毛細(xì)管電泳法中最為穩(wěn)定的區(qū)帶電泳技術(shù)，用紫外檢測(cè)器，對(duì)緩沖液種類、pH、分離電壓及進(jìn)樣方式等電泳條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了自然水體中諾氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFL)、四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲噁唑(SMZ)等3類6種抗生素的同時(shí)分離檢測(cè),探討了緩沖溶液種類對(duì)分離、分析的影響。

1 材料與方法

1.1材料 CL 1020高效毛細(xì)管電泳儀(配CL 101C型±30 kV可調(diào)高壓電源、紫外檢測(cè)器、HW-2000色譜工作站，北京彩陸儀器有限公司，中科院研究生院應(yīng)化所，中國(guó))；熔融石英毛細(xì)管柱65 cm×75 μm ，有效長(zhǎng)度55 cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司，中國(guó))；Orion828型pH儀(奧立龍公司，美國(guó))；GWA-UN1型超純水器(北京普析通用儀器有限公司，中國(guó))；Discovery DV215CD十萬分電子天平(奧豪斯公司，美國(guó))。NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，純度大于0.98；四硼酸鈉(Na2B4O7，分析純，重慶博藝化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；磷酸二氫鉀(KH2PO4分析純，西安化學(xué)試劑廠，中國(guó))；磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫鈉(Na2HPO4)、磷酸鈉(Na3PO4)、檸檬酸、檸檬酸鈉等其余試劑的純度均為分析純；自然水體采自嘉陵江石門大橋段。

1.2方法

1.2.1緩沖溶液的制備 精密稱取Na2B4O7、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、檸檬酸、檸檬酸鈉適量，分別用超純水溶解制成0.05、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.2 mol/L貯備液。根據(jù)種類和濃度需要配制運(yùn)行緩沖溶液，若需調(diào)節(jié)緩沖溶液pH時(shí)，則通過滴加1 mol/L NaOH及磷酸(H3PO4)溶液調(diào)節(jié)，用pH計(jì)精密測(cè)量。緩沖溶液使用前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ對(duì)照品適量，用超純水(已用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0左右)分別稀釋制成2.0 mg/mL對(duì)照品貯備液。

1.2.3供試品溶液的制備 精密稱取NOR、OFL、TC、OTC、SDZ、SMZ對(duì)照品適量，用自然水(已用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0左右)分別稀釋制成1.0、2.0、2.0、3.0、1.0、1.0 mg/mL的樣品貯備液。分別精密量取上述樣品貯備液各1 mL于50 mL容量瓶中，加自然水30 mL，用測(cè)試用緩沖溶液定容至刻線，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。臨用前配制，超聲處理10 min。

1.2.4電泳條件

1.2.4.1毛細(xì)管的處理 毛細(xì)管使用前，按順序用超純水、甲醇、超純水沖洗20、20、3 min，再分別用1 mol/L NaOH活化10 min、0.1 mol/L NaOH活化40 min，最后用超純水、緩沖溶液分別沖洗5、10 min即可。每次進(jìn)樣前都應(yīng)分別用0.1 mol/L NaOH沖洗5 min，超純水沖洗3 min，緩沖溶液沖洗5 min。

1.2.4.2優(yōu)化電泳條件 電動(dòng)進(jìn)樣25 kV×10 s，分離電壓22 kV，操作溫度20～22 ℃，優(yōu)化緩沖溶液為20 mmol/L Na2B4O7+10 mmol/L KH2PO4(pH=8.60)，檢測(cè)波長(zhǎng)確定為260 nm。取1.2.3項(xiàng)下供試溶液實(shí)驗(yàn)，其分離結(jié)果見圖1。

圖1 最優(yōu)電泳條件下的供試溶液毛細(xì)管電泳圖

2 結(jié) 果

2.1毛細(xì)管電泳分離條件優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 《中國(guó)藥典》2015年版記載，SMZ及其制劑定量檢測(cè)多采用240與254 nm，SDZ及其制劑定量檢測(cè)多采用260 nm，NOR及其制劑定量檢測(cè)多采用255～280 nm，OFL及其制劑定量檢測(cè)多采用290 nm，TC及其制劑定量檢測(cè)多采用280 nm、OTC及其制劑定量檢測(cè)多采用280 nm進(jìn)行檢測(cè)。為保證待測(cè)物質(zhì)均有較大吸收,本方法采用260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2進(jìn)樣方法的選擇 毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方法常有壓力進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣兩種方式。相對(duì)于樣品無差別進(jìn)樣的壓力進(jìn)樣方式，電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)樣品中目標(biāo)檢測(cè)品有一定的選擇性。當(dāng)采用壓力進(jìn)樣，自然水體中存在的泥沙膠體、腐殖質(zhì)等小粒徑懸浮物也進(jìn)入進(jìn)樣端，使得檢測(cè)時(shí)基線不穩(wěn)、毛刺增多，干擾嚴(yán)重。本方法采用了正極端進(jìn)樣，在電動(dòng)進(jìn)樣方式下，自然水體中的懸浮顆粒受電場(chǎng)影響，進(jìn)入進(jìn)樣端的量大大降低，可使基線噪聲降低、色譜峰峰形變好，能達(dá)到在線樣品凈化效果，降低干擾，提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。因此,本方法選擇了電動(dòng)進(jìn)樣方式。

2.1.3緩沖溶液種類、濃度及pH的優(yōu)化

2.1.3.1緩沖溶液種類的選擇 在采用了Na2B4O7-KH2PO4、Na2B4O7-NaH2PO4、Na2B4O7-Na2HPO4、Na3PO4-NaH2PO4、Na3PO4-Na2HPO4、檸檬酸鈉-檸檬酸等緩沖溶液體系后，本方案最終選擇了Na2B4O7-KH2PO4體系。本研究發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液種類對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳的分離效率影響極大，甚至大過緩沖溶液pH的影響。在pH為8.6時(shí)，分別以Na2B4O7-KH2PO4、Na2B4O7-NaH2PO4、Na3PO4-NaH2PO4體系為緩沖溶液，并保持近似的緩沖溶液離子強(qiáng)度。結(jié)果表明，硼砂體系的分離效率明顯優(yōu)于磷酸鈉鹽體系，磷酸鉀鹽體系優(yōu)于磷酸鈉鹽體系，如圖1、2所示。因此最終選擇Na2B4O7-KH2PO4體系為緩沖液。

A:20 mmol/L Na2B4O7+15 mmol/L NaH2PO4;B:20 mmol/L Na3PO4+15 mmol/L NaH2PO4

2.1.3.2緩沖溶液濃度的優(yōu)化 隨著緩沖液Na2B4O7-KH2PO4濃度的增加，樣品的出峰時(shí)間逐漸推后，并且基線噪音逐漸增大，提示這與緩沖溶液離子強(qiáng)度變大，運(yùn)行體系電流增加有關(guān)系。優(yōu)化后的緩沖溶液濃度為20 mmol/L Na2B4O7+10 mmol/L KH2PO4。

2.1.3.3緩沖溶液pH的優(yōu)化 本方法考察了不同pH對(duì)組分遷移時(shí)間和分離效率的影響,見圖3。最終確認(rèn)緩沖液優(yōu)化pH為8.60。

圖3 20 mmol/L Na2B4O7-10 mmol/L KH2PO4緩沖溶液不同pH對(duì)遷移時(shí)間的影響

2.1.4分離電壓的優(yōu)化 在分離電壓大于25 kV時(shí)，SDZ和SMZ、NOR和OFL無法實(shí)現(xiàn)良好分離，且毛刺明顯增多；分離電壓小于18 kV時(shí)分離時(shí)間超過50 min，組分自然擴(kuò)散加劇，峰展寬嚴(yán)重。最終的分離電壓確定為22 kV。

2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1重現(xiàn)性試驗(yàn) 取1.2.2對(duì)照品貯備液，按“1.2.4”項(xiàng)下電泳優(yōu)化條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，考察各組分峰面積和遷移時(shí)間的相對(duì)平均偏差(RSD)。6種抗生素峰面積的RSD為2.5%～4.7%，遷移時(shí)間的RSD為0.31%～0.48%，重現(xiàn)性良好，見表1。

2.2.2線性范圍 在優(yōu)化條件下，配制6組不同濃度的6種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，以峰面積的平均值計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1?？梢姡?.5～40.0 mg/L范圍內(nèi)6種抗生素的線性相關(guān)系數(shù)大于0.988，線性關(guān)系良好。

2.2.3檢出限 如表1所示，在優(yōu)化條件下，根據(jù)6種抗生素各為0.5 mg/L的供試溶液的峰高及基線噪音，以信噪比(S/N)≈3計(jì)算，6種抗生素的檢出限在0.08～0.55 mg/L。

表1 毛細(xì)管電泳重現(xiàn)性驗(yàn)證

2.2.4回收率試驗(yàn) 按優(yōu)化條件，以自然水體為基質(zhì)，對(duì)按“1.2.3”配制的供試溶液中6種抗生素進(jìn)行了50，100和200 μg/L水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)濃度水平進(jìn)行5次平行測(cè)定，得到的加標(biāo)回收率見表2，數(shù)據(jù)表明本文所建立的分析方法可靠性較高。

表2 加標(biāo)樣品回收率(n=5)

續(xù)表2 加標(biāo)樣品回收率(n=5)

3 討 論

本研究建立了水體中3類6種抗生素的分析方法，考察了緩沖溶液類型、pH、進(jìn)樣方式、分離電壓等因素對(duì)6種抗生素分離效果的影響。本研究發(fā)現(xiàn)緩沖溶液種類的選擇對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳的分離效率影響極大，本方法最終選擇了Na2B4O7-KH2PO4體系作為緩沖溶液。已知SMZ的pK=5.69[14]，SDZ的pK=6.36[14]；NOR的pK1和pK2分別為6.18和8.60[15]，OFL的pK1和pK2分別為6.20和8.20[15]；TC的pK1、pK2、pK3分別為3.2、7.5、8.9[12]，OTC的pK1、pK2、pK3分別為3.3、7.8、9.6[12]。根據(jù)各組分pK可知，在pH為6～7的供試品溶液中，各組分應(yīng)略帶正電荷；而自然水體中存在大量的泥沙膠體、腐殖質(zhì)等粒徑小于100 nm的懸浮粒主要帶負(fù)電荷[16]?；诖郎y(cè)組分和懸浮顆粒電荷的區(qū)別，本研究組采用了電動(dòng)進(jìn)樣方式以正極端進(jìn)樣。在進(jìn)樣時(shí)懸浮顆粒受電場(chǎng)的影響，進(jìn)入進(jìn)樣端的量大大降低，降低了水體中帶電懸浮顆粒對(duì)分離的干擾，實(shí)現(xiàn)了在線的樣品凈化，使得檢測(cè)的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和靈敏度大幅提高。

本方法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，具有明顯優(yōu)勢(shì)，能夠滿足自然水環(huán)境中殘留抗生素的檢測(cè)要求，為水環(huán)境中殘留抗生素的監(jiān)測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單可行的方案。