蔣莉梅，馬 慧，李 玲，白曉川

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液內(nèi)科 750004)

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方案已使絕大多數(shù)初治急性白血病(acute leukemia,AL)得到緩解。但大部分AL患者疾病復(fù)發(fā)仍是影響患者長(zhǎng)期生存白血病微小殘瘤，及預(yù)后的主要問題，一旦復(fù)發(fā)，治療難度明顯增加。復(fù)發(fā)的根本原因是患者體內(nèi)存在白血病微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是指AL患者在經(jīng)誘導(dǎo)治療緩解后用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法難以檢測(cè)出的體內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)[1]。應(yīng)用流式細(xì)胞數(shù)(FCM)監(jiān)測(cè)MRD動(dòng)態(tài)變化能更早發(fā)現(xiàn)白血病復(fù)發(fā)跡象，以便及早臨床干預(yù)，減少?gòu)?fù)發(fā)，改善生存。本研究通過回顧性分析應(yīng)用FCM動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成年AL患者在完全緩解(CR)后不同時(shí)間段內(nèi)MRD的變化情況，探討此項(xiàng)技術(shù)對(duì)判斷AL患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)價(jià)其預(yù)后及指導(dǎo)個(gè)體化治療的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009年9月30日至2016年6月7日在本院確診并行化療達(dá)CR的76例監(jiān)測(cè)過MRD的成年AL患者(年齡大于或等于14歲)的臨床資料，其中急性髓細(xì)胞白血病(AML)患者(非M3)57例，M1型7例，M2型24例，M4型12例，M5型12例，M6型1例，M7型1例；急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者19例，B-ALL 14例，T-ALL 3例，T/B-ALL 2例。AML患者中男34例，女23例，中位年齡40歲(14～74歲)。ALL患者中男11例，女8例，中位年齡29歲(15～60歲)。診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)價(jià)參照張之南等主編的第三版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]。

1.2治療方案 確診患者按照AL的標(biāo)準(zhǔn)化療方案進(jìn)行誘導(dǎo)治療，其中AML多采用以阿糖胞苷為主的吡柔比星+阿糖胞苷(TA)、米托蒽醌+阿糖胞苷(NA)、伊達(dá)比星+阿糖胞苷(HA)等方案，ALL多采用以長(zhǎng)春瑞濱+地塞米松(VP)為基礎(chǔ)的吡柔比星+長(zhǎng)春瑞濱+培門冬酶+地塞米松(DVLP)、吡柔比星+長(zhǎng)春瑞濱+培門冬酶+環(huán)磷酰胺+地塞米松(DVLCP)等方案。強(qiáng)化鞏固治療多使用原誘導(dǎo)緩解方案及大、中劑量阿糖胞苷單藥交替化療。

1.3隨訪 隨訪時(shí)間自確診時(shí)起，至患者復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止期2017年1月31日。失訪病例隨訪至末次就診時(shí)間。定義無進(jìn)展生存期(RFS)，為患者達(dá)CR后至其出現(xiàn)復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止期。

1.4方法

1.4.1研究方法 搜集76例自2009年10月至2016年6月于本院確診AL并經(jīng)誘導(dǎo)治療達(dá)血液學(xué)CR后監(jiān)測(cè)過MRD的成人患者資料，對(duì)AML及ALL患者在CR后3、6、12及12個(gè)月后MRD陽(yáng)性及陰性組復(fù)發(fā)率及RFS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.2微小殘留檢測(cè)方法 抽取患者CR后不同時(shí)間點(diǎn)骨髓液3～4 mL肝素鈉抗凝，采用FCM檢測(cè)(流式細(xì)胞儀由美國(guó)Becton-Dickinson公司生產(chǎn))，可供選擇的單克隆標(biāo)記方法有6色、8色及10色熒光分析，以CD45/SSC來設(shè)門，定義MRD≥1×10-4為陽(yáng)性，MRD<1×10-4為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)表示；計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示，比較采用χ2或Fisher確切概率法。生存曲線比較使用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1FCM檢測(cè)MRD與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果比較

2.1.1兩種檢測(cè)方法檢出率的比較 76例AL患者檢測(cè)MRD同時(shí)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。57例AML患者在隨訪期采用FCM方法內(nèi)分別檢測(cè)1～12次，中位檢測(cè)次數(shù) 3次，共檢測(cè)234例次；其中MRD陽(yáng)性40例次，陰性194例次，陽(yáng)性檢出率為17.1%；而骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)僅5例次，CR結(jié)果229例次，復(fù)發(fā)檢出率為2.1%，F(xiàn)CM檢測(cè)MRD陽(yáng)性率高于骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)檢出率(P<0.05)。19例ALL患者在隨訪期內(nèi)采用FCM方法分別檢測(cè)1～9次，中位檢測(cè)次數(shù)2次，共檢測(cè)57例次；其中MRD陽(yáng)性17例次，陰性40例次，陽(yáng)性檢出率為29.8%；而骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)僅4例次，CR結(jié)果53例次，復(fù)發(fā)率為7.0%，F(xiàn)CM檢測(cè)MRD陽(yáng)性率高于骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)檢出率(P<0.05)。

2.1.2兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性與復(fù)發(fā)時(shí)間比較 骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)的5份AML標(biāo)本中有1份在提前于形態(tài)學(xué)3個(gè)月發(fā)現(xiàn)MRD陽(yáng)性，另外4份同時(shí)發(fā)現(xiàn)MRD陽(yáng)性。骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)的4份ALL標(biāo)本中有1份在提前于形態(tài)學(xué)1個(gè)月發(fā)現(xiàn)MRD陽(yáng)性，另外3份同時(shí)發(fā)現(xiàn)MRD陽(yáng)性。

2.2不同治療階段MRD與復(fù)發(fā)及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間關(guān)系

2.2.1AML患者

2.2.1.1AML患者首次CR后3個(gè)月 此階段33份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性組7例，6例均在3個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，1例未復(fù)發(fā)；MRD陰性組26例，復(fù)發(fā)5例，其中僅1例在MRD陰性后6個(gè)月復(fù)發(fā)；4例分別在MRD陰性后7～13個(gè)月復(fù)發(fā)。MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率高于MRD陰性組(P<0.05)。MRD陽(yáng)性組及MRD陰性組的中位RFS分別為1.0個(gè)月(0～12個(gè)月)、13.5個(gè)月(3～37個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 AML患者首次CR后3個(gè)月MRD陰性及MRD陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.2.1.2AML患者首次CR后6個(gè)月 此階段24份標(biāo)本均為MRD陰性，復(fù)發(fā)6例，分別在MRD陰性后4～15個(gè)月復(fù)發(fā)，中位RFS為29.0個(gè)月(3～36個(gè)月)。

2.2.1.3AML患者首次CR 后12個(gè)月 此階段35份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性5例，復(fù)發(fā)2例，分別在MRD陽(yáng)性后1、10個(gè)月復(fù)發(fā)；MRD陰性30例，復(fù)發(fā)7例，分別在MRD陰性后1、3、4、5、6、12、15個(gè)月復(fù)發(fā)。兩組復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.586)。MRD陽(yáng)性組及陰性組的中位RFS分別為5.0個(gè)月(4～10個(gè)月)、25.0個(gè)月(1～35個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 AML患者首次CR后12個(gè)月MRD陰性及MRD

2.2.1.4AML患者首次CR 12個(gè)月后 此階段142份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性29例，復(fù)發(fā)12例(其中10例在MRD陽(yáng)性后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，僅2例分別在MRD陽(yáng)性后7、21個(gè)月復(fù)發(fā))；MRD陰性組113例，復(fù)發(fā)23例(其中僅4例在MRD陰性后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；19例分別在MRD陰性后7～36個(gè)月復(fù)發(fā))。MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率高于MRD陰性組(P=0.019)。陽(yáng)性組及陰性組的中位RFS分別為5.0個(gè)月(0～24個(gè)月)、13.0個(gè)月(1～45個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 AML患者首次CR 12個(gè)月后MRD陰性及MRD陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.2.2ALL患者

2.2.2.1ALL患者首次CR后 3個(gè)月 此階段9份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性4 例，其中3例分別在MRD陽(yáng)性后7個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，1例未復(fù)發(fā)；MRD陰性5例，僅1例在MRD陰性后5個(gè)月復(fù)發(fā)。兩組復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.206)。MRD陽(yáng)性組及MRD陰性組的中位RFS分別為4.5個(gè)月(0～10個(gè)月)、8.0個(gè)月(5～16個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 ALL患者首次CR后3個(gè)月MRD陰性及MRD陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.2.2.2ALL患者首次CR后6個(gè)月 此階段9份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性4例，其中2例在MRD陽(yáng)性后2個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；MRD陰性組5例，僅1例在MRD陰性后4月內(nèi)復(fù)發(fā)。兩組復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.524)。MRD陽(yáng)性組及MRD陰性組的中位RFS分別為3.0個(gè)月(0～5個(gè)月)、24.0個(gè)月(3～27個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 ALL患者首次CR后6個(gè)月MRD陰性及MRD陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.2.2.3ALL患者首次CR后12個(gè)月 此階段11份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性4例，其中3例分別在MRD陽(yáng)性后2個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；MRD陰性7例，均未復(fù)發(fā)。MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率高于MRD陰性組(P=0.024)。MRD陽(yáng)性組及陰性組的中位RFS分別為1.5個(gè)月(0～3個(gè)月)、10.0個(gè)月(3～25個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 ALL患者首次CR后12個(gè)月MRD陰性及陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.2.2.4ALL患者首次CR 12月個(gè)后 此階段29份標(biāo)本，MRD陽(yáng)性6例，均在MRD陽(yáng)性后15個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；MRD陰性23例，僅3例分別在MRD陰性后5～11個(gè)月復(fù)發(fā)。MRD陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率高于陰性組(P<0.05)。MRD陽(yáng)性組及MRD陰性組的RFS分別為10.0個(gè)月(0～15個(gè)月)、14.0個(gè)月(1～24個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 ALL患者首次CR 12個(gè)月后MRD陰性及MRD陽(yáng)性組的生存曲線圖

2.3動(dòng)態(tài)檢測(cè)MRD與治療轉(zhuǎn)歸 57例AML患者檢測(cè)出MRD的中位間隔時(shí)間為3個(gè)月(1～27個(gè)月)。其中11例在骨髓形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)前出現(xiàn)MRD陽(yáng)性，中位提前時(shí)間為2個(gè)月(1～22個(gè)月)。7例MRD陽(yáng)性后，經(jīng)加強(qiáng)治療MRD轉(zhuǎn)陰，但部分出現(xiàn)交替轉(zhuǎn)陽(yáng)。19例ALL患者檢測(cè)出MRD的中位間隔時(shí)間為3個(gè)月(1～10個(gè)月)。其中有3例在形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)前出現(xiàn)MRD陽(yáng)性，中位提前時(shí)間為3個(gè)月(1～6個(gè)月)。

3 討 論

已有研究顯示CR后MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果是 AL無病生存的獨(dú)立預(yù)后因素[3-5]。本研究分析了本院76例AL患者在首次CR后3、6、12及12個(gè)月后的4個(gè)階段MRD結(jié)果，顯示MRD陽(yáng)性組患者的中位RFS較MRD陰性組縮短；且相應(yīng)階段MRD陽(yáng)性組生存率較MRD陰性組低，但兩組的復(fù)發(fā)率并非在各階段都有顯著性差異?？赡苁懿±龜?shù)較少；檢測(cè)MRD的時(shí)間點(diǎn)及間隔時(shí)間無統(tǒng)一規(guī)范；部分患者的隨訪時(shí)間較短，隨訪期內(nèi)尚無復(fù)發(fā)跡象；取材、操作誤差等因素影響。而首次CR后3個(gè)月及12個(gè)月后MRD陽(yáng)性患者的復(fù)發(fā)相對(duì)更多，前者可能提示患者體內(nèi)白血病細(xì)胞存在原發(fā)耐藥克??；而后者多次化療后仍然檢出MRD陰性，提示存在白血病細(xì)胞繼發(fā)耐藥。目前相關(guān)研究相對(duì)較少，MARSHALL等[6]通過臨床研究，認(rèn)為第1、12、24個(gè)月時(shí)MRD高水平提示復(fù)發(fā)意義更大，與本研究基本一致。

本研究還顯示，F(xiàn)CM檢測(cè)AL患者M(jìn)RD陽(yáng)性率較形態(tài)學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)率高，多數(shù)患者在骨髓形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)前即可發(fā)現(xiàn)MRD陽(yáng)性，說明FCM的靈敏度更高，能更早發(fā)現(xiàn)AL復(fù)發(fā)跡象，以便及早采取對(duì)策。這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果基本一致。

有關(guān)MRD檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)及時(shí)間間隔，目前尚不統(tǒng)一，但普遍認(rèn)為在AL誘導(dǎo)緩解及鞏固治療后的時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)對(duì)判斷預(yù)后意義更大，時(shí)間間隔建議是每3個(gè)月檢測(cè)1次[7-8]。有關(guān)檢測(cè)MRD的時(shí)間間隔，或許根據(jù)不同時(shí)間段MRD的具體值及變化趨勢(shì)來制定，可能對(duì)指導(dǎo)患者的后續(xù)治療更有幫助。

有關(guān)FCM檢測(cè)MRD的陽(yáng)性閾值，眾多研究之間差異較大，從7.5×10-5～1.0×10-2不等，但大多采用的是0.01% 作為 MRD 陽(yáng)性閾值[9-11]。本研究也是以1×10-4為MRD陽(yáng)性閾值。此外，單次MRD陽(yáng)性的患者在隨訪期內(nèi)并非都出現(xiàn)骨髓形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)，而連續(xù)數(shù)次MRD陽(yáng)性患者更容易出現(xiàn)骨髓形態(tài)學(xué)復(fù)發(fā)；且多次MRD陽(yáng)性的患者如出現(xiàn)單次MRD陰性則仍需后續(xù)的監(jiān)測(cè)。只有連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD水平的變化才能對(duì)AL患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后判斷提供可靠的臨床依據(jù)。此外，部分患者M(jìn)RD的檢測(cè)結(jié)果是交替變化的，提示隨著治療的更改，MRD的檢測(cè)結(jié)果可出現(xiàn)一定程度的變動(dòng)，所以將FCM檢測(cè)MRD結(jié)果作為判斷治療效果的惟一指標(biāo)尚不可取。有條件者應(yīng)當(dāng)借助更為靈敏的檢測(cè)方法如分子學(xué)、基因測(cè)序等查找MRD。已有文獻(xiàn)提出增加AL患者緩解及治愈的分子學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。

綜上，F(xiàn)CM動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD對(duì)判斷AL患者的復(fù)發(fā)、預(yù)后及指導(dǎo)個(gè)體化治療有較大的臨床價(jià)值。但目前MRD檢測(cè)時(shí)間、間隔時(shí)間及陽(yáng)性閾值等尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。此外，提高檢測(cè)靈敏度也是亟待解決的問題之一。