陳煒瑋，林新富，楊 笑，黃昉萌，駱杰偉，吳永希，魏世超，鄭星宇＊＊

（1.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)科 福州 350001；3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院護理系外科護理學教研室 福州 350101；4.福建省立醫(yī)院兒科 福州 350001）

2007 年美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）為了揭示微生物與人體疾病之間的聯(lián)系，啟動了人類微生物組計劃（Human Microbiome Project，HMP）[1-2]。NIH牙顱頜面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research，NIDCR）在2008年啟動了人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫（Human Oral Microbiome Catabase，HOMD）計劃[3]。HOMD的主要目標是提供數(shù)百種人體口腔原核生物物種群落的全面信息。2015年再次啟動了“全民個體微生物組檢測項目”，旨在以口腔、皮膚及腸道微生物群落為主要研究靶點，將“人類微生物組計劃”的研究結(jié)果進行臨床轉(zhuǎn)化，從“第二基因組”中尋找更加精準的疾病預警分子標記。而因胃氣的強弱不同、感受邪氣的寒熱不同，形成了多樣的病理性舌苔[4]。本研究收集冠心病患者與健康對照者的舌苔標本，進行舌苔菌群16S rDNA的V4區(qū)域的高通量測序[5,6]，將現(xiàn)代測序技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)辨證相結(jié)合，探索不同中醫(yī)證型菌群的奧秘之處。

1 材料與方法

1.1 診斷標準

參照1979年WHO制定的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》[7]、2014年美國心臟病學會/美國心臟病學院《非ST段抬高型急性冠脈綜合征診治指南》、2015年《中國急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》，包括：穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征（包括不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死）、陳舊性心肌梗死。舌苔分級：（1）薄白苔（white thin coating，WTC）：苔色白，苔質(zhì)薄，透過舌苔能隱隱見到苔質(zhì)，舌苔潤澤有津，舌色淡紅，即“淡紅舌，薄白苔”。（2）黃厚苔（yellow thick coating，YTC）：苔色淡黃或黃，苔質(zhì)較厚（即不能透過舌苔見到舌質(zhì)），或部分舌面見厚苔，僅少部分舌面見薄苔，苔質(zhì)干或不干，舌色淡紅或紅。（3）很黃厚苔（extremely yellow thick coating，EYTC）：苔色黃，苔質(zhì)厚或極厚，全舌面見厚苔，苔質(zhì)干，舌色紅或絳紅。舌象診斷參照《中醫(yī)診斷學》[8]。每一個舌像均由固定的2位福建省立醫(yī)院中醫(yī)科副主任及以上醫(yī)師判定，并照相保存。

1.2 納入與排除標準

納入標準：經(jīng)福建省立醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，簽訂知情同意書。符合穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征、陳舊性心肌梗死標準患者。排除標準：排除3個月內(nèi)使用抗生素治療者；排除患有糖尿病、血液病、心力衰竭、腎衰等重要疾病者；排除有肝炎、結(jié)核病等傳染性疾病者；排除不能進行正常交流及合作者；排除有口腔頜面部腫瘤患者；排除有放、化療史者；排除有長期飲酒史者；排除有長期吸煙史者。

1.3 一般資料

共收集2015年12月至2016年3月于福建省立醫(yī)院就診且符合納入標準和排除標準的冠心病患者70例，平均年齡為64.64±7.27歲，其中男性40例，女性30例，薄白苔15例（男11例，女4例），黃厚苔33例（男17例，女16例），很黃厚苔22例（男12例，女10例）。收集同期來自福建省立醫(yī)院體檢中心的體檢人群中健康人組28例作為對照，健康對照組平均年齡為64.13±5.23歲，其中男性15例，女性13例，薄白苔28例。組間年齡、性別無顯著差異（P＞0.05）。

1.4 方法

1.4.1 舌苔樣本取備、DNA提取

舌苔取樣按照HMP手冊流程（Manual of Procedures for Human Microbiome Project，Version 12.0(Accession:phd003190.2)）。DNA提取嚴格按照QIAamp? DNA Mini Kit操作說明書進行。采用16s rRNA通用引物515F/806R（515F:XXXXXGTGCCAGCMGCCGCGGTAA,806R:XXXXXGGACTACVVGGGTATCTAATC）對提取的DNA樣品進行PCR擴增。XXXXX：每組內(nèi)標簽序列，用于不同組別、不同樣品的區(qū)分。

1.4.2 16s rRNA基因V4區(qū)測序

PCR擴增和產(chǎn)物純化后，文庫質(zhì)檢合格后，使用Ion Plus Fragment Library Kit進行文庫定量，并根據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求，進行相應比例的混合均一化。用16S特定引物擴增特異可變區(qū)V4區(qū)域，得到300bp左右擴增片段。采用Ion PGM?System測序，對照組28個樣品采用兩個Ion 314?C hip K it v2芯片，其余樣品采用一個Ion 318?Chip Kit v2芯片。

1.4.3 OTU聚類

將序列完全一樣的Clean Reads按其豐度大小排序。過濾掉其中的Singletons（singletons為對應read只有一條的序列，疑因測序錯誤所致，為減少誤差，將這部分序列去除，不進入后期OTU聚類）。再將所有的序列用vsearch分析軟件去嵌合體，按相似度0.97進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類，對聚類后的OTU進行篩選，只保留大于兩條的OTU（類似與之前的singletons篩選）。將豐度大于2的OTU代表序列用rdp-classifier進行物種注釋，得到物種豐度表。統(tǒng)計各樣本中各OTU的豐度信息，將各個OTU中豐度最高的一條序列挑選出來，作為該OTU的代表序列。使用RDP方法，將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類。

1.4.4 顯著性差異分析

在兩組樣本中采用Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測不同組間豐度差異顯著的物種；再用成組的Wilcoxon秩和檢驗，對在上一步中獲得的顯著差異物種進行組間差異分析；最后用線性判別分析（LDA）對數(shù)據(jù)降維和評估具有顯著差異的物種的影響力，即LDA score（差異菌群判定標準為LDAscore大于3，P值小于0.01）。用R語言軟件進行treeplot構(gòu)建，進行舌苔菌群類型分析。

2 結(jié)果

2.1 OTU與物種注釋分析

統(tǒng)計出來的OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。采用cutadapt配合python腳本的方法進行拆分，并統(tǒng)計每個樣品的測序條數(shù)，使用卡方檢驗分析兩組間reads，冠心病reads中位數(shù)21969.50（17468.75-33261.00）多于對照組中位數(shù)16753.00（13326.25-24492.25），具有統(tǒng)計學意義（Z值=-2.253，P=0.024）。本實驗共得到10506個不同的OTU，找出兩組間有顯著差異的OTU有1068個（P＜0.05）。物種注釋分析將1068個差異OTU（P＜0.05）與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫進行比對。根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門水平得到16個物種，綱水平得到31個物種，目水平得到51個物種，科水平得到86個物種，屬水平得到160個物種。本實驗中在屬水平上找出有差異的物種84個（P＜0.05）。

表1 2組有顯著作用的微生物類群（線性回歸分析，LDA）

圖1 LDA effectsize進化分支圖

2.2 LDAEffectSize（LEfSe）

分析采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小，找出對樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種[9]。本實驗組間有差異物種，見表1。LDA effectsize進化分支圖，見圖1。分析可以看出，冠心病優(yōu)勢菌屬有棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、布克氏菌屬（Burkholderialles）、乳酸菌屬（Lactobacillus）；對照組優(yōu)勢菌屬有消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、lachnoanaerobaculum、紅細菌目（rhodobacterales）、紅桿菌科（rhodobacteraceae）。

圖2 屬水平上的treeplot構(gòu)建

圖3 4組group的冠心病組與對照組菌群占比分布圖

2.3 舌苔菌群類型分析

對樣品進行聚類為四大類（圖2）。group1的優(yōu)勢菌屬是鏈球菌屬（Streptococcus），group2的優(yōu)勢菌屬是普雷沃氏菌屬（Prevotella），group3的優(yōu)勢菌屬是梭桿菌屬（Fusobacterium），group4的優(yōu)勢菌屬是奈瑟菌屬（Neisseria）。四種group特點（圖3）。group1中普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、奈瑟菌屬在CHD組、對照組占比均分列前三。group2中，CHD組的呈優(yōu)勢占比的菌屬依次為鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬和羅氏菌屬（Rothia）；對照組為羅氏菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬。group3中，CHD組占比優(yōu)勢菌屬分別為普雷沃氏菌屬、奈瑟菌屬、鏈球菌屬；對照組則為普雷沃氏菌屬、奈瑟菌屬、梭桿菌屬。group4的CHD組占比優(yōu)勢菌屬依次為奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬；對照組則為奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬。

表3 各group舌苔情況預測

2.4 菌群分型風險預測

各組患冠心病風險預測（表2）。以group1為參照，group2、3、4患冠心病的風險遞增。而罹患冠心病風險較高的group2，group3，group4又在菌群特征上有明顯不同，提示冠心病可能存在特定的菌群結(jié)構(gòu)。各group舌苔情況預測，見表3。以group1為參照，group2、3、4患薄白、黃厚、很黃厚舌苔遞增關(guān)系。

2.5 RDA分析

冗余分析（redundancy analysis,RDA）主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，見圖4。group3與hs-CRP、IL-6、IL-8等炎癥指標密切相關(guān)。

3 討論

《舌鑒總論》中云：“舌為心之外候，苔為胃之明證，察舌可占正之盛衰，驗苔以識邪之出入”。舌苔是由脾胃之氣上熏，胃津上潮，凝聚于舌面而成。若胃氣夾邪氣上泛于舌，就會形成病理性舌苔?？谇晃⑸锝M與牙周疾病、心血管疾病之間的聯(lián)系一直倍受關(guān)注?？谇痪旱氖Ш鈺踊蚣觿用}硬化過程[10]。泡沫細胞形成是動脈硬化初始關(guān)鍵步驟，低密度脂蛋白（LDL）與牙齦卟啉菌的特異性蛋白結(jié)合，聚集的LDL可誘導鼠巨噬細胞形成泡沫細胞[11]。此外，在動脈粥樣斑塊中找到韋榮菌、普雷沃氏菌、牙齦卟啉單胞菌、梭桿菌、華麗單胞菌屬等的報道[12,13]。斑塊中韋榮球菌屬、鏈球菌屬豐度與在口腔中的豐度相關(guān)，并且細菌與白細胞、血漿膽固醇水平相關(guān)[14]。牙齒的獨特結(jié)構(gòu)可以促進細菌生物膜的沉積，細菌生物膜在牙齦邊緣處的過度積累會引起炎癥。微生物內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)會促進病原體毒力因子表達，如牙齦卟啉單胞菌可致齲齒或牙周炎等發(fā)生或加劇[15]。齲病、牙周病等常見口腔疾病患病率的升高，增加了人群罹患動脈粥樣硬化、冠心病等的風險[16,17]。Mattila等研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者的牙周健康狀況明顯差于健康組，多存在慢性牙周炎、齲壞、慢性根尖周炎、冠周炎等[18]。一項有關(guān)CHD與牙周炎相關(guān)性的Meta分析結(jié)果顯示牙周炎是獨立于傳統(tǒng)CHD危險因素的一種危險標記，相對危險度為1.24-1.35[19]。

牙周致病菌多為能產(chǎn)生脂多糖（LPS）的革蘭陰性菌，可導致牙周組織局部炎癥，并形成牙齦的潰瘍和局部血管化[20]。牙齦致病菌可通過炎癥的牙周組織進入血液，刺激內(nèi)皮細胞表達各種致炎因子，包括單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、細胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細胞黏附分子(VCAM-1)、E選擇素等，引起動脈炎癥，參與動脈粥樣硬化。此外，粥樣硬化斑塊形成后，牙周致病菌還能通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達，降低MMP組織抑制物表達，參與斑塊破裂[21]。血管平滑肌細胞感染牙齦卟啉單胞菌后，可致組織因子和纖溶酶原激活物等因子失調(diào)，導致高凝、血栓形成[22,23]。牙周致病菌及脂多糖等代謝產(chǎn)物在誘導局部炎癥和組織破壞的同時，還不斷刺激宿主，產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥與免疫反應，導致CRP、TNF-α、IL-113、IL-6等炎性因子上調(diào)[23,24]。另外，與消化道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（TMAO）有關(guān)，TMAO會抑制血液中膽固醇的降解，進一步促進動脈粥樣硬化發(fā)展[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)group 1、2、3、4的優(yōu)勢菌屬分別是Streptococcus、 Prevotella、 Fusobacterium、 Neisseria。Streptococcus為革蘭陽性菌，為口腔正常定植菌，為健康人及口臭者口腔中的優(yōu)勢菌群，與口臭等口腔癥狀密切相關(guān)[26]；prevotella是革蘭陰性專性厭氧菌，其可能為牙周疾病的主要可疑致病菌[27]。Neisseria是寄生在人體呼吸道的的條件致病菌屬，與牙菌斑生物膜形成有關(guān)，牙菌斑生物膜過量沉積會誘發(fā)牙周炎[28]。此外，梭桿菌、鏈球菌和奈瑟菌豐度與動脈粥樣硬化的危險信號如血漿膽固醇水平相關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)group3與hs-CRP、IL-6、IL-8等炎癥指標有較顯著的相關(guān)性。Fusobacterium是臨床常見的革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌，主要存在于口腔牙垢中，可致人的嚴重感染，如菌血癥等[29]。具核梭桿菌（F.nucleatum）存在于牙齦下斑塊中，是慢性牙周炎重要的感知生物體，其可以誘導外周嗜中性粒細胞的促炎細胞因子（IL-1β，TNF-α，IL-8）等的產(chǎn)生，參與慢性牙周炎炎癥反應[30]。

本研究通過OR值分析出舌苔菌群結(jié)構(gòu)與患冠心病風險相關(guān)，并影響著舌苔變化。有研究認為，冠心病舌色、苔色、舌形、舌苔厚度、瘀斑瘀點5類觀察值在各中醫(yī)證型有明顯差別[31]。冠心病不同亞型的舌苔也存在著差異性，隱匿型冠心病患者舌苔多為薄白苔，冠心病心絞痛患者舌苔改變以膩苔和少苔或無苔為主。其中不穩(wěn)定型冠心病心絞痛患者出現(xiàn)膩苔的幾率較穩(wěn)定型心絞痛患者高，且隨著病情的好轉(zhuǎn)，其舌苔逐漸轉(zhuǎn)為正常[32]。而且冠心病患者舌象的動態(tài)變化可以反映病情進展，預示冠心病的預后情況。如急性心肌梗塞時舌苔有明顯的由薄變厚、再由厚變薄的變化趨勢[33]。可見疾病特有的舌苔菌群結(jié)構(gòu)，使其發(fā)揮“疾病預警”的功能，將會為疾病防治提供新的靶點和思路。