毛堂友，裴文靜，史 瑞，趙興杰，王志斌，陳曉偉，陳 晨，

石 磊，譚 祥，孫中美，丁龐華，李軍祥＊＊

（北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院脾胃肝膽科 100078北京）

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的兩種形式之一，主要發(fā)生于結腸和直腸[1]，好發(fā)于年輕人，其腹痛、腹瀉、黏液膿血便等臨床癥狀嚴重影響患者的生活質量，被世界衛(wèi)生組織列為現代難治病之一[2]，也是目前消化領域的研究熱點。UC病程遷延不愈，復發(fā)率相當高，UC的嚴重并發(fā)癥——UC相關性結直腸癌的檢出率明顯升高，占UC患者死亡原因的10%-15%[3]。UC的發(fā)病率和患病率與經濟的發(fā)展程度呈現一定的相關性，主要見于北美和歐洲等發(fā)達國家。研究[4]顯示，北美地區(qū)UC的發(fā)病率約為37.5-248.6/10萬人/年，歐洲地區(qū)約為4.9-505/10萬人/年。亞洲UC患者病率及患病率較西方國家低，但近20年來呈逐年增加趨勢，尤其是日本、南韓、新加坡等[5]，Prideaux等[6]調查顯示，目前UC的發(fā)病率約為7.6-14.3/10萬/年，患病率為2.3-63.6/10萬/年。目前其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究顯示[7]，緊密連接蛋白的異常表達，從而直接影響腸黏膜屏障功能，是造成潰瘍性結腸炎的重要發(fā)病機制。本課題組前期研究[8,9]發(fā)現，清腸溫中方能夠明顯改善潰瘍性結腸炎患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應，修復腸粘膜損傷，但具體機制尚不清楚。因此，本研究將從腸黏膜屏障緊密連接蛋白claudin-1和claudin-4入手，進一步探討清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠（200±20）g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2011-0004），飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所。12小時光照/黑夜循環(huán)，溫度（20-24）℃，濕度50-60%；自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2 藥物

美沙拉嗪腸溶片（mesalazine）購自德國Losan Pharma GmbH公司。清腸溫中方（黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，青黛6 g，地榆炭15 g，苦參15 g，木香6 g，炙甘草6 g）購自北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院顆粒藥房。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical,Burlingame,CA,USA）,便潛血試紙（珠海貝索生物技術有限公司）；NF-κB抗體（abcam，Ab16502），Claudin-1抗體（abcam，Ab15098），Claudin-4抗體（Santa cruz，Sc-376643），Beta actin抗體（中杉金橋，TA-09）。

1.4 分組、造模及標本采集

動物模型的建立方法如前期研究[5]，概述如下：自由飲用4.5%DSS溶液制備大鼠UC模型，將60只健康SPF級雄性SD大鼠（體重200±20 g）適應性飼養(yǎng)1周后，以4.5%DSS(MW：36000-50000，MP Biomedical)溶液自由飲水7天，普通飼料喂養(yǎng)，同時運用隨機數字表法將大鼠隨機均等分為分為6組：正常組，模型組，清腸溫中方低劑量組、中劑量組、高劑量組，美沙拉嗪組。自由飲用4.5%DSS溶液的同時，各組均以相應藥物灌胃治療7天。每日稱取大鼠體重，觀察大便性狀，檢測便潛血，干預結束后，禁食不禁水24 h后取材，分離遠端結腸10 cm，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Real time-PCR檢測結腸Claudin-1、Claudin-4基因表達

提取結腸組織樣本的總RNA，逆轉錄后進行PCR擴增，Claudin-1上游引物CACTTCCAGACTCCAC?CACC，下游引物 AATCTTCCATTGGGGCAGGG，擴增片段長度275bp；Claudin-4上游引物AGCAATGACT?GGGGCCTTAC，下游引物 CCTAGCACTCCCCAAAC?CAG，擴增片段長度115 bp；內參GAPDH上游引物CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物 TTTAATGT?CACGCACGATTTC，擴增片段長度150 bp。PCR產物經電泳后，各種統(tǒng)計2一△△CT法進行數據的相對定量分析，計算Claudin-1、Claudin-4值。

1.6 Western blot檢測結腸Claudin-1、Claudin-4蛋白表達

將結腸組織裂解后，離心取上清液，置于BSA標準液中，檢測樣品蛋白含量。調整濃度后，進行電泳分離，分別加入claudin-1和claudin-4一抗以及二抗，漂洗后顯影、定影，圖像分析。

1.7 免疫組織化學檢測結腸NF-κB p65的表達

結腸組織石蠟切片（4 μm）經過酒精脫水、二甲苯脫蠟、抗原修復、封閉后，進行免疫組織化學染色（NF-κB p65抗體濃度1∶2000，Beta actin抗體濃度1∶1000），以PBS為陰性對照，200倍鏡視野下采集圖片，image pro plus 6.0軟件分析圖像，計算光密度(IOD)和染色區(qū)域總面積（area），用平均光密度（IOD/area）來進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

所有的數據均以均值±標準差（）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件（IBM Corp,Armonk,NY,USA）分析，符合正態(tài)分布且方差齊進行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態(tài)分布或方差不齊進行非參數檢驗，均為組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-1的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸claudin-1的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸claudin-1的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），清腸溫中方各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸claudin-1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。見表1，圖1。

2.2 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-4的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸結腸claudin-4的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的claudin-4的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。見表2、圖2。

2.3 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸NF-κB p65的影響

NF-κBp65在正常組大鼠結腸組織中的陽性表達很少或幾乎沒有表達。在模型組及各治療組中，主要可見于病變結腸粘膜組織的腸黏膜層、黏膜肌層、肌層、漿膜層，而各治療組較模型組的表達相對較少，其組織切片陽性表達染色主要為深棕黃色或褐色，圖3。

表1 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-1的影響（）

表1 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-1的影響（）

組別正常組模型組清腸溫中方低劑量組清腸溫中方中劑量組清腸溫中方高劑量組美沙拉嗪組n 10 10 10 10 10 10 claudin-1mRNA 1.67±0.54 0.86±0.23##1.09±0.62 1.17±0.24*1.31±0.32*1.28±0.38*claudin-1蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08*0.29±0.05*0.31±0.02*0.35±0.04*

圖1 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-1蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組NF-κBp65的平均光密度明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結腸的NF-κB p65平均光密度顯著降低（P＜0.05），見表3。

表2 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-4的影響（）

表2 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-4的影響（）

組別正常組模型組清腸溫中方低劑量組清腸溫中方中劑量組清腸溫中方高劑量組美沙拉嗪組n 10 10 10 10 10 10 claudin-4mRNA 1.20±0.38 0.71±0.21#0.83±0.32 0.99±0.17*1.02±0.24*1.00±0.19*claudin-4蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08 0.30±0.04*0.31±0.02*0.35±0.04*

圖2 清腸溫中方對DSS誘導UC大鼠結腸claudin-4蛋白表達的影響

3 討論

圖3 清腸溫中方對UC大鼠結腸NF-κB p65蛋白的影響（IHC，×200）

UC的發(fā)病機制仍未完全闡明，目前大多學者認為持續(xù)腸道感染、腸黏膜屏障缺損、腸黏膜免疫調節(jié)異常、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了疾病發(fā)生過程，其中，腸黏膜屏障受損是潰瘍性結腸炎發(fā)病的關鍵因素[6]。腸黏膜屏障由機械屏障（腸黏膜上皮細胞）、化學屏障（黏膜表面黏液層+消化液等）、免疫屏障（相關淋巴組織細胞群和黏膜分泌的免疫球蛋白）和生物屏障（腸道菌群）等4個方面共同構成[7]。機械屏障是機體防御的第一道防線，由腸黏膜上皮細胞及其細胞間的連接組成，后者主要包括緊密連接（tight junction，TJ）、粘附連接（adherens junctions，AJ）和縫隙連接（gap junction，GJ），而其中TJ是腸上皮細胞間的主要連接方式，在維持腸上皮細胞極性和調節(jié)腸黏膜屏障的通透性中發(fā)揮著重要的作用。

TJ是由一系列蛋白、脂肪組成的復合體，連續(xù)地存在于細胞與細胞之間。TJ主要有兩大功能：一是“屏障功能”，即調節(jié)著離子、水分子、大分子甚至癌細胞的通路；二是“籬笆”功能，則主要與保持細胞極性有關，阻止在頂膜部位的分子與在側膜的分子相互混合[8]。因此，當緊密連接的完整性受到破壞時，腸上皮緊密連接功能的缺失（又稱為“漏腸”），可引起腸上皮通透性增加[9,10]，腸道的細菌、病毒及其他微生物、物中的大分子蛋白等即可通過受損的緊密連接進入機體，引起免疫反應，引發(fā)一系列疾病，潰瘍性結腸炎的發(fā)病也與此相關。緊密連接蛋白是TJ的主要組成部分，包括跨膜蛋白家族（claudin蛋白、occludin蛋白）、結腸黏膜扣帶蛋白（cingulin）、連接黏附分子（junctional adhe?sion molecules,JAMs）、膜周蛋白家族（zonula occlu?dins，ZOs）等結構蛋白及各類連接蛋白分子，它們通過肌動蛋白和肌球蛋白II與細胞骨架相連[11,12]。緊密連接蛋白在維持腸黏膜屏障功能及調控細胞間通透性發(fā)揮著關鍵作用，因此，緊密連接蛋白的異常表達，則會直接影響腸黏膜屏障功能，這也是潰瘍性結腸炎的重要發(fā)病機制之一[13]。因此，尋求對腸上皮緊密連接具有保護作用的藥物，對治療潰瘍性結腸炎具有重要的意義。

Claudins蛋白是構成緊密連接的主要骨架蛋白，是維持和調節(jié)細胞旁通透性關鍵蛋白。Claudin-1是最早分離出來的緊密連接蛋白，是構成緊密連接的主要骨架蛋白之一，在維持腸粘膜上皮細胞屏障功能和緊密連接的完整性發(fā)揮著關鍵作用。研究表明[14]，Claudin-1的表達減少或結構破壞時，可引起黏膜屏障功能紊亂，導致緊密連接功能失調和組織滲透性的增加，使得腸上皮細胞通透性增加，腸腔外源性抗原進入，免疫反應異?？哼M，從而促進潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展。Claudin-4蛋白作為緊密連接蛋白家族成員之一，共有209個氨基酸組成，主要分布在肺、腎、腸和腦中，編碼基因定位于人類染色體7q11.23。Claudin-4蛋白一方面可以維持上皮細胞完整性，加強細胞間的連接，起到屏障作用，另一方面，在細胞頂端形成了緊密連接線，把上皮細胞質膜分成頂側的脂質部分和基側的蛋白部分，并阻止它們之間的相互彌散，以保持細胞的極性[15]。當claudin-4蛋白表達減少時，可破壞緊密連接復合體的結構，導致腸道黏膜屏障功能受損，進而引起抗原移位、免疫損傷，促進潰瘍性結腸炎的發(fā)生。另外，研究表明，潰瘍性結腸炎與NF-κB密切相關[16,17]。當機體受到脂多糖等外界刺激時，NF-κB會與IκB分離，進入細胞核，調控IL－6、TNF-α等炎性細胞因子的表達，引起機體炎癥反應，同時下調claudin-1、claudin-4等緊密連接蛋白的表達，造成腸黏膜屏障受損，促進UC的發(fā)生發(fā)展[18,19]。

表3 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸NF-κB p65的影響（）

表3 清腸溫中方對DSS誘導的UC大鼠結腸NF-κB p65的影響（）

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

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本次實驗研究發(fā)現，模型組大鼠claudin-l、clau?din-4的基因和蛋白水平較正常組降低（P＜0.01，P＜0.05），提示提示DSS可抑制大鼠結腸黏膜緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達，而經過清腸溫中方的干預后，結腸claudin-l、claudin-4的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。由此可以推測，清腸溫中方能夠通過上調claudin-l、claudin-4的表達，修復損傷的結腸黏膜屏障。而進一步研究發(fā)現，與正常組相比，模型組大鼠結腸NF-κB p65的平均光密度水平均顯著升高（P＜0.01）；而經過清腸溫中方的治療后，中劑量組、高劑量組大鼠結腸NF-κB p65的平均光密度水平顯著降低（P＜0.05），由此說明，清腸溫中方可能是通過抑制NF-κB p65的表達，抑制腸道炎癥反應，從而促進緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達水平，修復腸粘膜損傷，達到治療UC的目的。清腸溫中方是本課題組李軍祥教授根據多年臨床經驗而創(chuàng)立的經驗方，主要用于寒熱錯雜、濕熱瘀阻證的潰瘍性結腸炎，主要由黃連6 g炮姜10 g三七6 g青黛6 g地榆炭15 g苦參15 g木香6 g炙甘草6 g等組成，其中黃連清熱利濕、厚腸止瀉，炮姜溫經止血、健脾止瀉，二者合為君藥，一寒一溫，意在調和陰陽、平調寒熱；苦參清熱燥濕，青黛清熱解毒、涼血消斑，三七化瘀止血，三者共為臣藥，佐均藥清熱利濕，同時還可入營血，涼血、活血、止血；木香行氣止痛，地榆炭涼血止血、解毒斂瘡，二藥共為使藥，一氣一血，具有行氣止血的功效；炙甘草為使藥，調和諸藥，同時還具有補中益氣的作用。本方主要針對脾胃虛寒為本，濕熱瘀阻為標的證型，其中“清腸”，即清利腸道濕熱，與本研究中下調NF-κB p65的表達而抑制腸道炎癥反應相對應；而“溫中”，即溫補中焦脾胃，增強衛(wèi)氣的防御功能，與本研究中清腸溫中方促進緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達水平而修復腸粘膜損傷相類似。

本次研究通過動物實驗探討了清腸溫中方通過抑制NF-κB p65、促進claudin-l、claudin-4治療潰瘍性結腸炎的作用機制，但是其上下游的調控機制尚不清楚，另外中藥的作用往往是網狀調控的，本研究所示的claudin-l、claudin-4是否是發(fā)揮作用的主要途徑？還有沒有其他通路，甚至是其主要作用的通路或者靶點？這些目前均不得而知。因此，下一步，我們需要深入研究相關的上下游靶點，并擴充思路，深入研究腸道菌群、腸黏膜免疫等方向的研究，從而完善清腸溫中方治療潰瘍性結腸炎的作用機制。