(濟寧醫(yī)學院藥學院，日照 276826)

基于熒光探針的熒光成像技術，能夠實現(xiàn)對細胞活動可視化和實時監(jiān)控，并具有靈敏度高、選擇性好和無創(chuàng)傷等優(yōu)點，在生命醫(yī)學領域發(fā)揮著重要作用，已成為近幾年研究的熱點[1]。其中，近紅外(near-infrared,NIR)熒光探針(吸收和發(fā)射波長在600～900 nm之間)因比短波長探針具有對生物樣品光損傷小，不受樣品自發(fā)熒光的干擾，且能穿透深層組織等顯著優(yōu)勢而備受關注。隨著熒光成像技術在藥物輸送及癌癥診斷和治療等生物醫(yī)藥領域的廣泛應用，對NIR熒光探針的需求也日益增加，迫切需要開發(fā)更多新型結構和功能的NIR熒光染料[2]。

香豆素類熒光染料具有優(yōu)異的光物理和化學性質，如熒光量子產率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好和易于修飾等，被廣泛用于各種離子、活性物質的檢測以及核酸和蛋白質分子的熒光標記[3]。但該類染料主要在短波長(400～520nm)區(qū)域發(fā)射，易受背景熒光的干擾，限制了其在活體成像中的應用。所以，對香豆素進行結構修飾，開發(fā)在NIR區(qū)域發(fā)射的香豆素類熒光染料具有重要的學術和應用價值。為此，化學家們付出了大量努力，已開發(fā)了許多新穎的香豆素類NIR熒光染料。本文將根據(jù)結構類型進行分類，對近幾年報道的香豆素類NIR熒光染料及其應用進行歸納總結，為設計開發(fā)更多具有新型結構和功能的香豆素類NIR熒光染料提供參考。

1 含半花菁結構的NIR香豆素類熒光染料

花菁染料是近些年備受青睞的大分子熒光標記和顯像染料，具有摩爾吸光系數(shù)大、熒光性能良好等優(yōu)點，但光穩(wěn)定性較差是其一個嚴重的缺陷。花菁染料中帶正電的半花菁部分作為優(yōu)異的電子受體，被廣泛用于新型熒光染料的開發(fā)。近些年，科研工作者將半花菁結構引入到香豆素中，開發(fā)出了大量新型的NIR香豆素-半菁類熒光染料，它們的結構見圖1，光學性質和應用見表1。

圖1 含半花菁結構的NIR香豆素類熒光染料

香豆素-半菁類染料可通過不同的反應機制與各種離子、活性物質和生物大分子反應，從而產生熒光的變化，因此其可作為探針被廣泛用于以上各種物質的檢測和顯像，并且具有選擇性好、靈敏度高以及細胞滲透性好等優(yōu)點。

另外，將香豆素與半菁結構結合，不僅能改善花菁部分的光穩(wěn)定性，還能使香豆素的吸收和發(fā)射光譜顯著向NIR區(qū)域移動。從表1可知，這些染料均具有較大的發(fā)射波長和Stokes位移。它們的最大發(fā)射波長大多在630～720nm的NIR區(qū)域，Stokes位移大多在50～90nm，而化合物7和10b高達150nm和130nm。

對比圖1的結構不難發(fā)現(xiàn)，通過延長共軛鏈可以明顯增大化合物的最大發(fā)射波長和Stokes位移，如染料7較染料1和2，染料10b較染料10a，最大發(fā)射波長和Stokes位移均有顯著增大；但隨著共軛鏈的增加，合成難度也會相應增大。通過在結構中引入一些水溶性基團，還可以明顯改善染料的水溶性，如染料4和10，分別在結構中引入了羧基和磺酸基，大大提高了它們的水溶性。

總之，香豆素-半菁類染料以其優(yōu)異的光學性質，較高的選擇性和靈敏度，良好的細胞滲透性，多樣的反應機制和易于修飾的優(yōu)勢，已被廣泛用于生物檢測和成像，相信未來會有更多反應機制和新型結構的此類染料會被設計開發(fā)出來。

表1 含半花菁結構的NIR香豆素類熒光染料的光學性質與應用

注：λabs，最大吸收波長，λem，最大發(fā)射波長，PBS，磷酸緩沖鹽溶液，pH=7.4;Buffer，CH3CN/磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液=1/4。

2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料

將共軛剛性環(huán)引入到熒光母體中，往往能增大其發(fā)射波長，增強光穩(wěn)定性和提高熒光量子效率?？蒲泄ぷ髡咴谙愣顾氐慕Y構中并入共軛剛性環(huán)，合成了一些具有優(yōu)異光學性質的共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料。它們的結構見圖2，光學性質和應用見表2。

圖2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料

Wang課題組[13-14]將派洛寧Y結構并入到香豆素中，設計合成了多個半月形(Crescent-shape)香豆素類NIR熒光染料11和12；隨后，該課題組又在結構中引入羧酸，合成了水溶性NIR染料13[15]。Huang等[16]將苯并咪唑結構并入亞氨基香豆素結構合成了新型結構NIR熒光染料14。

從表2可以看出，染料11、12、13的最大發(fā)射波長在640～690nm的NIR區(qū)域，Stokes位移介于53～78nm之間；結構分析可以發(fā)現(xiàn)，當香豆素7-位氮上連有環(huán)狀結構時，其最大發(fā)射波長和Stokes位移都要大于連二甲基時?；诒讲⑦溥蚝蛠啺被愣顾亟Y構設計的染料14，雖然Stokes位移較染料11、12、13有所減小，其最大發(fā)射波長卻高達715nm以上，這種結構為合成含多種功能基團的NIR熒光染料提供一個新的思路。

細胞成像實驗證明，染料11、12和13適用于活細胞中線粒體、溶酶體以及核仁RNA的成像，并具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性、良好的細胞通透性和較低的細胞毒性。其中，染料12b通過與核仁RNA結合，能快速染色活細胞核仁，比核仁色素SYTO RNASelect，更高的光穩(wěn)定性和選擇性，具有非常好的應用前景。

表2 共軛剛性環(huán)并香豆素類NIR熒光染料的光學性質及應用

3 含有二氟硼絡合物結構的香豆素NIR染料

二氟硼結構是強缺電子體系，是非常好的電子受體。以二氟硼結構為母體的分子大都具有優(yōu)良的光物理和光化學性能。如二吡咯甲川(BODIPY)是其中的杰出代表，但它們的缺點是Stokes位移一般較小(15～30nm)。將二氟硼結構引入香豆素，一些近紅外發(fā)射的二氟硼-香豆素類染料相繼被開發(fā)出來，其結構見圖3，光學性質見表3。

圖3 含有二氟硼絡合物結構的香豆素NIR染料

其中，Sekar課題組在二氟硼-香豆素類NIR染料的開發(fā)中做了大量工作，如他們基于姜黃素結構，合成了含有二氟硼結構的雙香豆素染料15和16[3]；將二氟硼和咔唑環(huán)引入到香豆素結構中合成了染料17[17]；將二氟硼和查耳酮結構引入到香豆素中，合成了染料18[18]；將芳基偶氮(Ar-N=N-)和二氟硼引入香豆素中，合成了染料19[19]。Bochkov等[20]將香豆素并入BODIPY中，合成了一系列新型不對稱香豆素并BODIPY的NIR染料20。

從表3可以看出，這些染料具有優(yōu)異的光學性質，特別是Stokes位移較BODIPY類化合物有著顯著增大，大都在90nm以上，而化合物20高達144nm。它們的最大發(fā)射波長均在640nm以上，化合物20和16甚至達到750和780nm。從圖3中的結構可以發(fā)現(xiàn)，染料最大發(fā)射波長與連接兩個芳環(huán)的共軛鏈長度有關，如染料15和16的最大發(fā)射波長明顯大于17，18和19。

雖然二氟硼-香豆素類NIR染料具有較大的最大發(fā)射波長和Stokes位移，但在極性溶劑中極低的熒光量子產率限制了其在生物檢測和成像方面的應用，未來如能解決這一缺陷，相信這類染料會有很大的應用空間。

表3 含有二氟硼絡合物結構的香豆素NIR染料的光學性質

4 含多個氰基的香豆素類NIR熒光染料

氰基作為一個強吸電子基團，是熒光染料中常用的電子受體。在香豆素3-位通過共軛雙鍵引入多氰基基團，而在7-位引入給電子基如羥基和二乙胺基，可通過分子內電荷轉移(ICT)實現(xiàn)香豆素發(fā)射光譜的紅移。

圖4 含多個氰基的NIR香豆素熒光染料

表4 含多個氰基的NIR香豆素熒光染料的光學性質與應用

注:HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。

從表4可以發(fā)現(xiàn)，這些染料大都具有超過650nm的最大發(fā)射波長和非常大(>90nm)的Stokes位移，染料22b和24甚至能達到149和150nm。對比它們的結構可以發(fā)現(xiàn)，隨著共軛體系的增大，化合物的最大發(fā)射波長也相應發(fā)生紅移，如染料21、22和24的最大發(fā)射波長依次增大；而Stokes位移與共軛體系大小無直接聯(lián)系。Tathe等[23]通過計算證實，在香豆素4-位引入氰基會使分子發(fā)射光譜發(fā)生明顯紅移。

5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結構的NIR香豆素類熒光染料

羅丹明和苯并吡喃鎓類熒光染料具有對光穩(wěn)定性好、較寬的波長范圍和較高的熒光量子產率等優(yōu)點，被廣泛應用于生物醫(yī)學領域的熒光檢測和標記。為開發(fā)更多新型結構和優(yōu)異性能的熒光染料，科研工作者將香豆素引入到這兩種結構中，開發(fā)了幾種基于羅丹明或苯并吡喃鎓結構的NIR香豆素類熒光染料，其結構見圖5，光學性質和應用見表5。

圖5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結構的NIR香豆素熒光染料

如Chen等[25]將香豆素并入羅丹明分子骨架中，開發(fā)了新型深紅色熒光染料25。25酯化得到的化合物可以選擇性地染色線粒體和檢測Hg2+。Dai等[26]基于香豆素和苯并吡喃鎓鹽結構，開發(fā)了對肼有高選擇性和敏感性的NIR比率熒光探針26，對肼的檢測限為1.5ppb，并成功地用于胎牛血清和活體細胞中肼的成像。Niu等[1]將基于香豆素和苯并吡喃鎓鹽，構建了三個新的NIR熒光染料27a-27c。從表5可知，基于羅丹明結構的染料25最大發(fā)射波長在640～690nm之間，Stokes位移介于50～75nm之間，其最大發(fā)射波長和Stokes位移隨香豆素7-位氮原子上剛性環(huán)的個數(shù)增加而變大。基于苯并吡喃鎓的香豆素類染料的光學性質受結構影響更為明顯，在香豆素上多一個苯環(huán)的染料27，其最大發(fā)射波長和Stokes位移分別達到814和148nm以上，比染料26分別增大120nm和100nm以上，27是目前已知香豆素染料中擁有最長發(fā)射波長的化合物，為以后設計此類NIR染料提供了重要的參考。

細胞成像實驗表明，這兩類染料都顯示了良好的耐光性和較低的細胞毒性，其中染料25比市售染料MitoTracker具有更好的光學性質和更低的細胞毒性，表明這些染料在活體成像中具有良好的開發(fā)潛力和應用前景。

表5 基于羅丹明或苯并吡喃鎓結構的NIR香豆素熒光染料的光學性質與應用

6 總結與展望

綜上所述，香豆素優(yōu)異的光學性質和易于修飾的結構特點，使得香豆素類染料一直是研究開發(fā)的熱點。根據(jù)不同的合成策略，引入不同的基團，近些年已有許多不同結構類型的香豆素類NIR熒光染料被相繼開發(fā)出來，并被應用到各種小分子、離子、活性粒子、pH的檢測和細胞成像上。目前來看，香豆素-半菁染料是研究最多和應用最廣的一類化合物；而二氟硼-香豆素類NIR染料雖具有優(yōu)異的光學性質，但在極性溶劑中較低的熒光量子產率限制了其在生物檢測和成像中的應用。隨著更多新型NIR熒光染料的涌現(xiàn)，將它們與香豆素結構相融合，相信未來會有更多結構新穎和性能良好的香豆素類NIR熒光染料會被開發(fā)出來。