(濟寧醫(yī)學院生物科學學院，日照 276826)

在體內(nèi)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡對于生物體來說至關(guān)重要，而該平衡的維持主要依靠泛素蛋白質(zhì)酶系統(tǒng)[1]以及自噬-內(nèi)溶酶體系統(tǒng)[2]。在泛素蛋白酶系統(tǒng)中，泛素通過泛素激活酶、結(jié)合酶和連接酶的作用結(jié)合到蛋白質(zhì)底物上，作為蛋白降解的標志被28S蛋白酶復(fù)合體所識別啟動蛋白質(zhì)的降解[1]。除了參與蛋白降解外，泛素化修飾也是生物體蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式，幾乎在所有功能細胞內(nèi)部發(fā)揮著重要的作用，這些作用包括蛋白質(zhì)降解，DNA損傷反應(yīng)，應(yīng)激和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3]。

泛素最初是從牛胸腺中分離出來，隨后發(fā)現(xiàn)泛素高度保守，普遍存在于從原生動物到脊椎動物的活細胞中，由分子量為8.4～8.5kDa的74～76個氨基酸殘基組成[4]。泛素研究主要集中于高等動植物體內(nèi)，但是對于海洋無脊椎動物的研究較少，目前僅在擬穴青蟹[5]、太平洋牡蠣[6]等物種中有所報道。單環(huán)刺螠屬于螠蟲動物門，螠綱，無管螠目，刺螠屬，是居住在潮間帶和潮下帶U型洞穴的海洋無脊椎生物，也是無管螠目在我國存在的唯一物種[7]。本文以單環(huán)刺螠為研究對象，克隆單環(huán)刺螠泛素基因，分析其結(jié)構(gòu)特征及其器官分布規(guī)律，為單環(huán)刺螠泛素基因功能的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 單環(huán)刺螠購買于山東省日照市石臼水產(chǎn)市場，產(chǎn)地為煙臺近海潮間帶，于實驗室內(nèi)通氣人工海水(18℃、pH 7.8和鹽度26)不投餌暫養(yǎng)。

1.1.2取樣 暫養(yǎng)3天后，挑取6只個體對體壁、肛門囊、中腸、后腸和體腔液進行取樣，液氮凍存，-80℃長期保存。

1.1.3儀器及試劑 試劑主要為Trizol(上海生工)、乙醇(國藥集團)、氯仿(國藥集團)、異丙醇(國藥集團)、瓊脂糖(上海生工)、Golden View(Solarbio)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Takara)和熒光定量試劑盒TB Green Premix Ex Taq(Takara)，引物由上海生工公司合成。

儀器主要為PCR儀(Biorad S100)、電泳儀(北京六一)、凝膠成像(Biorad GelDoc XR)和熒光定量PCR儀(Biorad CFX Connect)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取單環(huán)刺螠器官mRNA，將0.1 g組織加入1ml Trizol溶液中，電動勻漿器勻漿，根據(jù)Trizol說明書的步驟提取RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。隨后根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)說明書的流程反轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA。

1.2.2單環(huán)刺螠泛素基因的克隆及分析 利用太平洋牡蠣泛素基因(注冊號：JQ030888)在單環(huán)刺螠轉(zhuǎn)錄組(注冊號：SRA122323)中進行BLAST搜索，獲得單環(huán)刺螠泛素的相似序列，隨后利用開放閱讀框(open reading frame,ORF)finder確定序列的ORF，設(shè)計ORF驗證引物(表1)進行PCR，模板1μl，2 × PCR Mix 5μl(上海生工)，正向引物(2μM)4μl，反向引物(2μM)4μl，水6μl，總體積為20μl?；靹螂x心后，行PCR擴增，96℃預(yù)變性10 min；96℃ 30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。隨后對PCR產(chǎn)物測序驗證。確定后利用NCBI查找其他物種泛素基因序列，利用CLUSTAL X2對其進行多序列比對，獲得其保守序列；利用MEGA 7軟件采用鄰位相連法對其進行進化分析。

1.2.3單環(huán)刺螠泛素基因表達分析 利用qRT-PCR對單環(huán)刺螠泛素基因在各個器官中的表達分布規(guī)律進行分析。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板利用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(Takara)行在進行qRT-PCR檢測，2×TB Green Premix Ex Taq 10μl、正、反向引物(2mM)各4μl，模板2μl。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火延伸1min，40個循環(huán)；隨后進行溶解曲線反應(yīng)驗證產(chǎn)物擴增的特異性。β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt方法來確定目的基因的相對表達。引物見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺螠泛素基因的克隆

利用已知的與單環(huán)刺螠在進化上關(guān)系最近的太平洋牡蠣泛素基因在單環(huán)刺螠轉(zhuǎn)錄組中進行BLAST獲得單環(huán)刺螠泛素序列，全長500 bp，利用ORF Finder發(fā)現(xiàn)其ORF在37～270位點，長度234 bp，利用設(shè)計的ORF引物(表1)行PCR驗證，其電泳結(jié)果如圖1所示，PCR后獲得單一條帶，大小在250 bp左右，與預(yù)測大小基本一致，測序公司測序確定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

其序列特征如圖2所示，序列全長500 bp，ORF長度234 bp，編碼76個氨基酸，分子式C382H638N106O119S1，含有1246個原子，相對分子質(zhì)量為8651.97，等電點是6.56。

圖1 單環(huán)刺螠泛素ORF驗證

2.2 單環(huán)刺螠泛素基因序列保守性及進化分析

利用多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠的泛素基因序列與其他物種的泛素基因具有高度的一致性，僅僅只有C端的一個氨基酸序列不同(圖3)。根據(jù)其多序列比對結(jié)果利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹，單環(huán)刺螠與無脊椎動物聚為一枝，再與高等脊椎動物聚為一枝，與進化關(guān)系基本保持一致。見圖4。

圖2 單環(huán)刺螠泛素基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 泛素序列比對分析圖

圖4 泛素進化分析

2.3 單環(huán)刺螠泛素基因在各器官中表達特征

分析單環(huán)刺螠泛素基因在單環(huán)刺螠各個器官中的表達規(guī)律，體腔液中表達量最低，其次是腸道，后腸的表達量是體腔液的2.39倍，中腸是2.78倍，然后是體壁，表達量是體腔液表達量的3.46倍，而肛門囊表達量最高，達到體腔液表達量的4.55倍。除體腔液外，其他器官中泛素基因的相對表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖5。

注：與體腔液泛素基因mRNA相比，*P<0.05。

3 討論

泛素蛋白質(zhì)酶系統(tǒng)一直是生物科學的研究熱點之一，泛素蛋白與目標蛋白的共價結(jié)合介導(dǎo)蛋白的選擇性降解是泛素參與的經(jīng)典途徑，這一途徑廣泛存在于真核生物中[8]。因此，為了維持功能的穩(wěn)定，泛素基因序列從高等無脊椎動物到低等的真菌具有高度的保守性，例如人和酵母的泛素基因僅有3個氨基酸殘基的差別[9]。本研究克隆得到的單環(huán)刺螠泛素基因蛋白質(zhì)序列與其他物種的序列也具有極高的保守性，僅僅在C端存在著一個氨基酸的不同，這些結(jié)果進一步說明泛素基因在生物進化過程中具有相同的祖先，而且進化過程中為了維持功能的穩(wěn)定，序列幾乎不發(fā)生變異，從另外角度也證明了其功能的重要性。

單環(huán)刺螠泛素基因在各器官中廣泛存在，而且除體腔液外在其他器官中的表達量無統(tǒng)計學差異，這一結(jié)果恰好與泛素基因的名字在各組織中廣泛存在相對應(yīng)，這也與擬穴青蟹中泛素在各器官中的分布規(guī)律一致[5]。但是泛素基因在精卵發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，其表達量會出現(xiàn)顯著性的變化，例如在小鼠精原細胞中含量很低，精母細胞含量開始升高，到達精子表達量最高[10]。對于單環(huán)刺螠來說，其體腔液中會存在大量生殖細胞[11-12]，這會導(dǎo)致泛素基因的相對表達量改變。此外，泛素參與的非經(jīng)典途徑參與多種生理生化反應(yīng)，在低等的海洋無脊椎動物中，泛素具有抗菌的特性[6]，單環(huán)刺螠泛素的功能需要進一步的研究。