賀永健,劉瑞菁,劉 煥,鄭冬冬,汪河偉,周 雄,柳春紅,2*

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氨基脲誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)行為毒性及其生化機(jī)制

賀永健1,劉瑞菁1,劉 煥1,鄭冬冬1,汪河偉1,周 雄1,柳春紅1,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

為探究氨基脲(SEM)染毒對(duì)SD大鼠的神經(jīng)行為毒性及其作用機(jī)制,將44只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組,SEM低、中、高劑量組,每組11只,分別以0,7.5,15,30mg/(kg·bw)SEM的劑量連續(xù)灌胃染毒28d.染毒前后分別通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試神經(jīng)行為.采用液相色譜法測(cè)定γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(GLU),ELISA法測(cè)定5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、單胺氧化酶(MAO)以及N-甲基-D-天氡氨酸受體(NMDAR)含量.結(jié)果顯示,高劑量染毒組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)總距離和中央?yún)^(qū)域距離顯著低于對(duì)照組(<0.05),各劑量組大鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比均顯著低于對(duì)照組(<0.05或<0.01).與對(duì)照組相比,各染毒組大鼠腦組織中GABA含量和MAO活性均有不同程度降低,而GLU,NMDAR,5-HT,NE和DA水平均有不同程度上升.SEM誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)行為毒性的機(jī)制與破壞GABA和GLU的相互轉(zhuǎn)化、增加NMDAR含量以及抑制MAO活性導(dǎo)致單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平上升3個(gè)途徑有關(guān).

氨基脲；γ-氨基丁酸；N-甲基-D-天氡氨酸受體；單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)；神經(jīng)行為毒性

氨基脲(SEM)是肼的衍生物,又叫氨基甲酰肼,能為CH5N3O.SEM對(duì)動(dòng)物體會(huì)產(chǎn)生多方面的毒性作用,不僅會(huì)在組織形態(tài)學(xué)水平上導(dǎo)致多種組織器官的形態(tài)改變,而且還可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響,同時(shí)還表現(xiàn)出弱遺傳毒性[1-2].SEM的主要來(lái)源之一是硝基呋喃類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝[3-4].硝基呋喃類(lèi)藥物是一種的常用抑菌藥物,曾一度在我國(guó)以及全球各地水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛運(yùn)用,其藥物殘留已成為一種全球性問(wèn)題[5-6].SEM的穩(wěn)定性很強(qiáng),在環(huán)境中半衰期長(zhǎng),持久潴留,很難被消除[7].由于硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留危害日漸清晰,許多國(guó)家都已經(jīng)頒布了相關(guān)法令來(lái)監(jiān)管硝基呋喃類(lèi)藥物的使用.

已有研究報(bào)道,SEM在日常生活中的各種食品、用具和環(huán)境中均存在[8-9],并證實(shí)了其潛在的各種毒性作用[10-11],隨著毒理學(xué)的發(fā)展,神經(jīng)行為毒性指標(biāo)作為傳統(tǒng)毒理學(xué)指標(biāo)的補(bǔ)充扮演著越來(lái)越重要的角色.行為學(xué)效應(yīng)是內(nèi)在生理生化過(guò)程的外在表現(xiàn),而且直觀敏感.目前有關(guān)SEM的神經(jīng)行為效應(yīng)及其毒作用機(jī)制尚不明確.為此,本研究以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)和高架十字迷宮(EPM)實(shí)驗(yàn)作為神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)手段,通過(guò)28d經(jīng)口毒性試驗(yàn)觀察了SEM的神經(jīng)行為毒性,并從神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(GLU)的轉(zhuǎn)化以及N-甲基-D-天氡氨酸受體(NMDAR)刺激下丘腦分泌相關(guān)激素方面進(jìn)行探究,同時(shí)結(jié)合單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化,從下丘腦-垂體-性腺軸通路揭示SEM誘導(dǎo)神經(jīng)行為毒性的作用機(jī)制.以期為制定環(huán)境中SEM的神經(jīng)毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù),同時(shí)為今后SEM毒性效應(yīng)的深入研究提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SEM(純度399%,美國(guó)sigma公司);GABA(純度399%,上海阿拉丁試劑有限公司);GLU(純度399%,美國(guó)sigma公司);考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所);大鼠NMDAR測(cè)定試劑盒、5-羥色胺(5-HT)測(cè)定試劑盒、去甲腎上腺素(NE)測(cè)定試劑盒、多巴胺(DA)測(cè)定試劑盒、單胺氧化酶(MAO)測(cè)定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司);曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、高架十字迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司);Ethovision 8.0型行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司);液相色譜儀(配RF-20A熒光檢測(cè)器,日本島津公司);Enspire Xenon Light Module多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PE公司);5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);冷凍研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)技術(shù)有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠44只,4~5周,體重100~120g,一批次購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(粵)2013- 0002.購(gòu)回后單籠飼養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后按體重采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分組法[12]分為4組:對(duì)照組(C組)和低劑量組(L組)、中劑量組(M組)、高劑量組(H組),每組11只.低、中、高劑量組分別以7.5、15、30mg/(kg·bw)SEM溶液灌胃,對(duì)照組灌以同等體積的蒸餾水.SEM的LD50(半數(shù)致死量,指能夠引起試驗(yàn)動(dòng)物一半死亡的藥物劑量)為123mg/kg[13],本實(shí)驗(yàn)以LD50的10%~25%作為28d經(jīng)口毒性試驗(yàn)的最高劑量組(GB15193.22-2014)[14].每天上午9:00灌胃,灌胃體積為1mL,連續(xù)染毒28d.實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食、飲水,動(dòng)物室溫度22~24℃,相對(duì)濕度45%~ 55%.

1.2.2 行為學(xué)測(cè)試 分別在適應(yīng)期結(jié)束后和染毒結(jié)束后2個(gè)階段對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn).其中,OFT實(shí)驗(yàn)在EPM實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行,兩項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分2d完成.進(jìn)行行為實(shí)驗(yàn)前,徹底清潔OFT和EPM裝置,設(shè)置好相關(guān)程序,保證實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好.提前1h將所有大鼠轉(zhuǎn)移至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室,以適應(yīng)環(huán)境.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),從籠內(nèi)輕輕取出大鼠(背對(duì)實(shí)驗(yàn)者)將大鼠放入OFT或EPM裝置,實(shí)驗(yàn)者立即離開(kāi),通過(guò)動(dòng)物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)采集大鼠5min內(nèi)在OFT或EPM中的活動(dòng)信息.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%的酒精徹底清潔裝置,并用毛巾擦干.行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)如下, OFT實(shí)驗(yàn):總距離、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù);EMP實(shí)驗(yàn):進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比和運(yùn)動(dòng)總距離.

1.2.3 組織樣品的制備及測(cè)定 低溫環(huán)境中分離出下丘腦和額葉皮質(zhì),準(zhǔn)確稱(chēng)重后立即放入-80℃環(huán)境中.測(cè)定前用已預(yù)冷pH 7.4的PBS溶液沖洗組織并吸干,按照質(zhì)量:體積=1:9的比例為每份下丘腦和額葉皮質(zhì)精確量取對(duì)應(yīng)體積的預(yù)冷PBS溶液,低溫環(huán)境下勻漿,將勻漿在4℃溫度下2000r/min離心20min,離心結(jié)束后取上清液,即得10%下丘腦勻漿和10%額葉皮質(zhì)勻漿,待測(cè).腦組織中NMDAR、5-HT、NE、DA、MAO的檢測(cè)采用ELISA試劑盒,其蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū).

1.2.4 大鼠海馬中GABA和GLU的測(cè)定 低溫環(huán)境中分離出海馬組織后,準(zhǔn)確稱(chēng)重并立即放入-80℃冰箱保存.測(cè)定時(shí)將凍存的海馬組織取出,4℃環(huán)境下加入1mL預(yù)冷的甲醇-水溶液,低溫勻漿后10000g離心15min取上清,置于4℃冰箱待測(cè).液相色譜條件為:流動(dòng)相A(0.1mol/L醋酸鉀),流動(dòng)相B(甲醇),洗脫方式為二元梯度洗脫,梯度洗脫程序(t,B%)為(0,45%),(1,65%),(6,75%),(20,45%),其中指時(shí)間(min),B%指流動(dòng)相B所占的比例.檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)為250nm,發(fā)射波長(zhǎng)為410nm,柱溫35℃,流速1.0mL/min.測(cè)定前,取標(biāo)準(zhǔn)液或者樣品液于EP管中,加入同體積的鄰苯二甲醛衍生化試劑反應(yīng)2min后過(guò)濾膜,進(jìn)樣20μL[15].

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,當(dāng)方差齊時(shí),采用LSD檢驗(yàn);當(dāng)方差不齊,采用Tamhane’s檢驗(yàn),差異顯著水平表示為<0.05,極顯著水平表示為<0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基脲對(duì)大鼠一般狀況的影響

2.1.1 大鼠的外觀與精神狀態(tài) 在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中,各組動(dòng)物均有不同程度的變化.對(duì)照組大鼠精神良好,充滿(mǎn)活力,無(wú)掉毛脫毛現(xiàn)象,飲食較為正常.染毒組大鼠相對(duì)于對(duì)照組大鼠來(lái)說(shuō),普遍活動(dòng)減少,精神狀態(tài)不佳,并伴有不同程度掉毛脫毛現(xiàn)象,飲食減少,體重增長(zhǎng)較為緩慢.

2.1.2 大鼠的體重變化情況 SEM染毒對(duì)大鼠體重的影響見(jiàn)圖1.實(shí)驗(yàn)期間,各組大鼠的平均體重均隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng).對(duì)照組大鼠的體重一直高于其他各組大鼠同期的體重,低、中、高劑量組大鼠體重的增長(zhǎng)速率因SEM的染毒濃度升高而降低,且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)越來(lái)越明顯,這表明SEM對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了影響.

圖1 SEM對(duì)大鼠體重的影響

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 OFT結(jié)果 染毒前后各組大鼠OFT行為測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1和表2.OFT實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物在新環(huán)境中具有的恐懼和探究的矛盾心態(tài)來(lái)觀察其焦慮狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)裝置[16].范興文等[17]研究發(fā)現(xiàn),大鼠越傾向于在曠場(chǎng)周邊區(qū)域活動(dòng)時(shí),其焦慮程度越高;相反,越傾向于在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí),其焦慮程度越低.表1可知,各組大鼠OFT指標(biāo)在染毒前均無(wú)顯著性差異(>0.05).由表2可知,與對(duì)照組相比,SEM染毒中劑量組和高劑量組大鼠曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)總距離顯著小于對(duì)照組(<0.05),高劑量組大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離顯著低于對(duì)照組(<0.05),說(shuō)明SEM對(duì)中、高劑量組大鼠產(chǎn)生了一定的致焦慮作用.

表1 染毒前各組大鼠OFT行為比較(Mean±SD,n=11)

表2 染毒后各組大鼠OFT行為比較(Mean±SD,n=11)

注:與對(duì)照組比較,*:<0.05;**:<0.01(下同).

2.2.2 EPM結(jié)果 染毒前后各組大鼠EPM行為測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3和表4.EPM是利用動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索和高空開(kāi)臂的恐懼心理來(lái)觀察其焦慮狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)裝置[18].大鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比越低,表明其焦慮程度越高.表3可知,各組大鼠OFT實(shí)驗(yàn)結(jié)果在染毒前均無(wú)顯著性差異(>0.05).由表4可知中、高劑量組大鼠在高架十字迷宮中運(yùn)動(dòng)總距離顯著低于對(duì)照組(<0.05),各染毒組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比均顯著低于對(duì)照組(<0.05或<0.01).表明SEM對(duì)各組大鼠均產(chǎn)生了一定的致焦慮作用.

表3 染毒前各組大鼠EPM行為比較(Mean±SD,n=11)

表4 染毒后各組大鼠EPM行為比較(Mean±SD,n=11)

2.3 SEM對(duì)大鼠海馬中GABA和GLU的影響

圖2 SEM對(duì)大鼠海馬中GABA的影響(n=11)

各組大鼠在染毒結(jié)束后海馬中GABA和GLU含量如圖2和圖3所示.可知隨著染毒劑量的增加,大鼠海馬中GABA逐漸降低而GLU卻逐漸升高.由統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),高劑量組海馬中大鼠的GABA含量顯著低于對(duì)照組(<0.05),中、高劑量組海馬中大鼠的GLU含量顯著高于對(duì)照組(<0.05).

圖3 SEM對(duì)大鼠海馬中GLU的影響(n=11)

2.4 SEM對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)中NMDAR的影響

各組大鼠在染毒結(jié)束后額葉皮質(zhì)中的NMDAR含量如圖4所示.隨SEM染毒劑量的增加,各劑量組大鼠額葉皮質(zhì)中NMDAR含量均有所上升,且中、高劑量組大鼠額葉皮質(zhì)中NMDAR含量顯著高于對(duì)照組(<0.05).

圖4 SEM對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)中NMDAR的影響(n=11)

2.5 SEM對(duì)大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)及酶的影響

各組大鼠在染毒結(jié)束后下丘腦和額葉皮質(zhì)中的5-HT含量如圖5所示.隨SEM染毒劑量的增加,各劑量組大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中5-HT含量逐漸上升,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,且高劑量組大鼠下丘腦中5-HT、各劑量組大鼠額葉皮質(zhì)中5-HT含量分別顯著高于其對(duì)照組(<0.05或<0.01).

各組大鼠在染毒結(jié)束后下丘腦和額葉皮質(zhì)中的NE含量如圖6所示.隨SEM染毒劑量的增加,各劑量組大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中NE含量均呈逐漸上升趨勢(shì),且高劑量組大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中NE含量顯著高于對(duì)照組(<0.05或<0.01).

圖5 SEM對(duì)大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中5-HT的影響(n=11)

圖6 SEM對(duì)大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中NE的影響(n=11)

各組大鼠在染毒結(jié)束后下丘腦和額葉皮質(zhì)中的DA含量如圖7所示.隨SEM染毒劑量的增加,各劑量組大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中DA含量逐漸上升,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,且高劑量組大鼠額葉皮質(zhì)和各劑量組大鼠下丘腦中的DA含量顯著高于對(duì)照組(<0.05或<0.01).

各組大鼠在染毒結(jié)束后下丘腦和額葉皮質(zhì)中的MAO活性如圖8所示.隨SEM染毒劑量的增加,各劑量組大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中MAO含量逐漸下降,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,且中、高劑量組大鼠下丘腦和各劑量組大鼠額葉皮質(zhì)中MAO含量顯著低于對(duì)照組(<0.05或<0.01).

3 討論

OFT與EPM的實(shí)驗(yàn)原理相似,在神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)藥物等方面均有廣泛應(yīng)用,是評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮、抑郁狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能的經(jīng)典行為學(xué)方法[19-20],其不僅能夠被用于焦慮應(yīng)激模型的創(chuàng)建中, 也能較為準(zhǔn)確和方便地測(cè)定焦慮狀況[21].本實(shí)驗(yàn)中,染毒前的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均顯示各組大鼠之間無(wú)顯著差異,表明在染毒前大鼠的焦慮程度是處于同一水平的.在染毒結(jié)束后的OFT實(shí)驗(yàn)中,中、高劑量組大鼠在曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的總距離、高劑量組大鼠在中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)的距離均顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明SEM對(duì)大鼠的神經(jīng)行為狀態(tài)產(chǎn)生了一定影響,造成了焦慮.在在染毒結(jié)束后的EPM實(shí)驗(yàn)中,中、高劑量組大鼠高架十字迷宮總距離顯著低于對(duì)照組,各劑量組大鼠開(kāi)臂時(shí)間百分比和開(kāi)臂次數(shù)百分比均顯著低于對(duì)照組,表明SEM誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了焦慮癥狀.上述2種行為學(xué)測(cè)試都證明SEM染毒使大鼠出現(xiàn)了焦慮情緒,對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了毒性作用,且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系.

圖7 SEM對(duì)大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中DA的影響(n=11)

圖8 SEM對(duì)大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中MAO的影響(n=11)

在哺乳動(dòng)物體內(nèi),α-酮戊二酸經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)生成GLU,之后GLU在谷氨酸脫羧酶(GAD)的作用催化下會(huì)生成GABA,而GABA在GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABAT)的催化作用下又會(huì)生成琥珀酸半醛和GLU,最后再轉(zhuǎn)化為琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)中進(jìn)行代謝[22].研究表明GABA能在下丘腦-垂體-性腺軸上參與調(diào)節(jié)激素分泌,與促性腺激素(GtHs)的含量有著密切關(guān)系[23],同時(shí)GABA還可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的含量來(lái)誘導(dǎo)黃體產(chǎn)生雌激素,進(jìn)而起到協(xié)調(diào)作用[24],這提示GABA在性激素分泌的生理過(guò)程中起到了重要作用.GABA神經(jīng)元數(shù)量非常大,在人體中的比例約為25%~30%,主要是存在于大腦皮層、海馬、紋狀體等組織和器官中[25].在SEM染毒后,GABA的降低和GLU的升高說(shuō)明了從GLU向GABA的轉(zhuǎn)化出現(xiàn)了抑制,使得GABA不足而GLU累積過(guò)多.有學(xué)者研究表明了SEM正是GLU向GABA轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素GAD的抑制劑[26-27],由此推斷SEM是GABA合成酶GAD的抑制劑,它抑制了GAD的酶活性或者含量,從而導(dǎo)致GABA與GLU的互相轉(zhuǎn)化失衡,最后造成神經(jīng)毒性效應(yīng).

與GABA類(lèi)似,NMDAR也參與了下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié),所不同的是NMDAR是作用于下丘腦而GABA作用于垂體.NMDAR可刺激下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(GnRH),而其亞組NR2b也能對(duì)促黃體生成激素產(chǎn)生抑制作用,以此來(lái)參與性激素的調(diào)節(jié)[28].在SEM染毒后,NMDAR的含量隨染毒劑量的增加而上升,這與李歡歡等[29]研究報(bào)道的不同類(lèi)型的應(yīng)激能導(dǎo)致動(dòng)物一些腦區(qū)中NMDAR數(shù)量和興奮性氨基酸(EAAs)含量增加,且活性變高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符.當(dāng)增多的NMDAR和EAAs結(jié)合后,會(huì)激活NMDAR從而導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素含量上升,這種共同作用產(chǎn)生興奮毒性損傷從而造成腦組織中的神經(jīng)元細(xì)胞死亡或變性.另一方面則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中鈣離子的超負(fù)荷,而其破壞其蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終會(huì)影響到大腦區(qū)域中的信號(hào)傳導(dǎo)功能和突觸的可塑性,導(dǎo)致動(dòng)物表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的神經(jīng)行為障礙和毒性反應(yīng)[29].有研究[10]也指出,SEM會(huì)干擾NMDA信號(hào)傳導(dǎo)通路,通過(guò)這一途徑來(lái)產(chǎn)生毒性效應(yīng),其作用類(lèi)似于較弱的MK-801(又稱(chēng)地佐環(huán)平,是一種NMDA受體拮抗劑).

除了上述可能的影響機(jī)制外,SEM對(duì)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)和MAO的影響也有一定規(guī)律.單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)能調(diào)節(jié)機(jī)體中大腦中樞系統(tǒng)、心血管組織系統(tǒng)和部分器官中的內(nèi)外分泌過(guò)程[30].單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在各個(gè)腦組織中的含量及濃度對(duì)機(jī)體的神經(jīng)行為和認(rèn)知行為都有很大影響[31].而通過(guò)MAO的酶解是降解單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的主要方式,MAO能催化單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)氧化脫胺失活.本研究發(fā)現(xiàn),SEM染毒可抑制大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)內(nèi)MAO活性,同時(shí)使得5-HT、NE、DA的水平有不同程度升高.賴(lài)玉婷等[32]研究表明環(huán)境污染物壬基酚可通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)MAO酶活性,使5-HT分解代謝受阻,在體內(nèi)積累,導(dǎo)致5-HT水平升高,從而對(duì)5-HT在機(jī)體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生毒性作用.另有研究[33]也表明壬基酚可通過(guò)降低MAO活性而阻礙單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的正常分解,使得其水平上升導(dǎo)致焦慮.本研究結(jié)果與其結(jié)論相符,故SEM也可能通過(guò)抑制MAO而導(dǎo)致單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量升高,進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)行為毒性.

綜上,SEM的神經(jīng)毒性作用機(jī)制可能有以下3種途徑:抑制GAD的活性或含量,導(dǎo)致GABA和GLU的相互轉(zhuǎn)化不能處于正常的平衡狀態(tài);干擾NMDA信號(hào)傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致NMDAR含量增加;抑制MAO活性導(dǎo)致單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的上升.其對(duì)生物神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控可能的影響模式參見(jiàn)圖9.同時(shí),SEM通過(guò)影響下丘腦-垂體-性腺軸的正常激素分泌過(guò)程,并導(dǎo)致GABA、GLU和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[34]含量的異常,使得大鼠產(chǎn)生神經(jīng)毒性,出現(xiàn)焦慮情緒.

圖9 SEM對(duì)生物神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控的影響模式

4 結(jié)論

4.1 SEM短期重復(fù)染毒會(huì)對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用,使大鼠出現(xiàn)不同程度的焦慮狀態(tài) ,且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系.

4.2 SEM會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬組織中GABA含量顯著下降(<0.05),GLU含量顯著上升(<0.05).

4.3 SEM會(huì)導(dǎo)致大鼠額葉皮質(zhì)中NMDAR含量顯著上升(<0.05).

4.4 SEM會(huì)導(dǎo)致大鼠下丘腦和額葉皮質(zhì)中5-HT、NE和DA含量顯著上升(<0.05或<0.01),MAO含量顯著下降(<0.05或<0.01).

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The neurobehavioral toxicity and biochemical mechanism of semicarbazide in rats.

HE Yong-jian1, LIU Rui-jing1, LIU Huan1, ZHENG Dong-dong1, WANG He-wei1, ZHOU Xiong1, LIU Chun-hong1,2*

(1.Food College, South China Agricultural University, Guangzhou 510624, China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangzhou 510642, China)., 2018,38(12)：4713~4719

To study the neurobehavioral toxicity of semicarbazide (SEM) in rats and its biochemical mechanism. A total of 44male SD rats were randomly divided into 4groups (=11 per group): control group, low-dose group, medium-dose group, and high-dose group. SEM was intragastrically administrates at the dosage of 0, 7.5, 15, 30mg/kg (body weight) for 28days. The open field test (OFT) and elevated plus maze (EPM) were used to evaluated the neurobehavior in rats before and after exposure to SEM. The gamma-aminobutyric acid (GABA) and glutamate acid (GLU) of hippocampus were determined by liquid chromatography. ELISA method was used to mesure the contents of 5-hydroxytryptamine (5-HT), norepinephrine (NE), dopamine (DA), monoamine oxidase (MAO) and N-methyl-d-aspartic acid receptor (NMDAR). The results showed that the total distance traveled and the distance traveled in the center were significantly lower in the high-dose SEM group compared with the control group (<0.05). The open arm time percentage and open arm entries percentage were significantly lower in the SEM groups than in the control group (<0.05 or<0.01). Compared with the control group, the concentrations of GABA and the activity of MAO were decreased, whereas the levels of GLU, NMDAR, 5-HT, NE and DA were increased in different exposed groups. SEM might affect the nervous system of rats by damaging the mutual transformation of GABA and GLU, increasing the concentration of NMDAR and inhibiting the activity of MAO that directly enhance the levels of monoamine neurotransmitters.

semicarbazide；gamma-aminobutyric acid；N-methyl-d-aspartic acid receptor；monoamine neurotransmitters；neurobehavioral toxicity

X503.22

A

1000-6923(2018)12-4713-07

賀永健(1993-),男,湖北天門(mén)人,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院碩士研究生,主要從事食品質(zhì)量與安全研究.發(fā)表論文3篇

2018-05-02

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFC1601702);農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目(GJFP201801102);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2017LM2152)

* 責(zé)任作者, 教授, liuch@scau.edu.cn