宋騰飛

外周血造血干細(xì)胞移植是目前治療血液病、實(shí)體瘤及自身免疫病的有效方法之一, 采集物中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量對移植的成功有著直接的影響, 關(guān)于外周血造血干細(xì)胞采集的時機(jī)有不同的標(biāo)準(zhǔn)。臨床多以骨髓恢復(fù)期外周血白細(xì)胞數(shù)＞5×109/L為開始采集標(biāo)準(zhǔn), 也有以CD34+細(xì)胞絕對數(shù)為判斷標(biāo)準(zhǔn)［1-3］。采集采用COBM Spectra型血細(xì)胞分離機(jī), 血液流經(jīng)COBM Spectra型血細(xì)胞分離機(jī)離心槽袋后, 在一定離心力的作用下, 通過設(shè)定一定的離心參數(shù), 離心平衡后各種血細(xì)胞按一定的層次分布在離心容器內(nèi), 在不破壞這種平衡的條件下, 通過調(diào)整收集界面的位置, 相對準(zhǔn)確的將單個核細(xì)胞層(MNCs)收集入采血袋, 采集袋采用的是ACD-A抗凝,抗凝劑 ：血細(xì)胞為 1∶12［4］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月～2018年6月在本院進(jìn)行外周血造血干細(xì)胞移植的33例(96次采集數(shù)據(jù))患者作為研究對象, 由于CD34+百分率比較低, 根據(jù)患者病種不同及動員效果不同采用了13例患者(37次采集)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,37次采集CD34+百分率范圍為0.30%～1.77%, 平均0.636%。對單采后的血細(xì)胞分別進(jìn)行采集后0、24、48、72 h、＞72 h的臺盼藍(lán)拒染率及CD34+百分率的檢測分析。

1.2 儀器 臺盼藍(lán)染液(Beyotime的C0011系列)、BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀、BD CD34-PE抗體、BD CD45-FITC BD Mouse IgG1-PE BD FACS Lysing solution。

1.3 方法

1.3.1 臺盼藍(lán)操作原理及方法 利用正常的健康細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán), 而喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞可以被臺盼藍(lán)染色研制而成。嚴(yán)格來說, 臺盼藍(lán)染色檢測的是細(xì)胞膜的完整性,通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性, 即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。吸取100 μl重懸的細(xì)胞到以塑料離心管內(nèi), 加入100 μl臺盼藍(lán)染液, 輕輕混勻, 染色3 min, 吸取少量經(jīng)過染色的細(xì)胞, 用血細(xì)胞技術(shù)板計(jì)數(shù), 計(jì)數(shù)至少500個細(xì)胞。臺盼藍(lán)拒染率=藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2 CD34+百分率檢測 采用ISHAGH設(shè)門檢測方法：利用PBS將細(xì)胞調(diào)整到2×1010/L, 準(zhǔn)備100 ml稀釋標(biāo)本待測,取2個試管分別標(biāo)記陰性管、試驗(yàn)管, 分別加入CD45/IgG CD45/CD34, 每管內(nèi)加入50 μl稀釋后的標(biāo)本, 輕輕混勻, 4℃下避光放置30 min, 每管內(nèi)加入10倍稀釋的1 ml紅細(xì)胞溶解液混勻避光10 min, 300 g離心5 min, 棄上清, 加入500 μl PBS, 懸浮細(xì)胞上機(jī)檢測, 分析軟件選用BD CELLQuestTM軟件。設(shè)門方法見圖1。

2 結(jié)果

臺盼藍(lán)拒染率隨著時間的推移呈上升趨勢, 在72 h內(nèi)較穩(wěn)定, ＞72 h下降明顯, ISHAGH設(shè)門方法檢測CD34+百分率呈逐漸下降趨勢, 下降不明顯, ＞72 h下降明顯, 由此可見單采后動員的細(xì)胞盡量在24 h內(nèi)凍存處理, 最長不要超過72 h。見表1。

表1 不同的放置時間對CD34+率的影響(%)

3 小結(jié)

相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為粒單系祖細(xì)胞(CFU-GM)和祖細(xì)胞(BFU-E)在 24、48、72 h后下降率為90.0%、72.00%、68.00%［4］, 而CFU-GM產(chǎn)率與CD34+成正相關(guān)［5］, 本次實(shí)驗(yàn)與造血干采集物CD34+檢測相關(guān)報道相符［6］, 支持4℃保存造血干細(xì)胞只適合于72 h內(nèi)移植用。