王立明，姚國忠，徐清華，吳 醒

（江蘇省溧陽市人民醫(yī)院普外科，江蘇 溧陽 213300）

結(jié)直腸癌是臨床上常見的一種惡性腫瘤。該病具有很高的發(fā)病率。目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。大部分結(jié)直腸癌患者的病情被確診時已到中晚期。目前，臨床上對結(jié)直腸癌患者常進(jìn)行手術(shù)治療，但其預(yù)后較差。Beclin1（自噬基因）是一種多功能蛋白。其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的作用[1 ]。有資料顯示，Beclin1的表達(dá)可抑制患者癌組織的增殖、侵襲及遷移[2]。在本次研究中，筆者主要探討B(tài)eclin1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2012年2月至2013年11月期間江蘇省溧陽市人民醫(yī)院普外科收治的50例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。這些研究對象中，有男34例，女16例；其年齡為41～80歲，平均年齡為（59±2.23）歲；其中有低分化腺癌患者32例，有中高分化腺癌患者18例；其中腫瘤TNM分期為Ⅰ期及Ⅱ期的患者共有16例，為Ⅲ及Ⅳ期的患者共有34例。本研究經(jīng)過江蘇省溧陽市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

采集患者結(jié)直腸癌組織及正常組織將其制作成石蠟標(biāo)本。在為患者采集標(biāo)本前，其均接受了癌癥根治性手術(shù)，且其在術(shù)前未接受放、化療等抗腫瘤治療。將制作完成的石蠟標(biāo)本放置在-80℃的環(huán)境下進(jìn)行冷凍保存。本次研究采用的試劑為：購自美國CST公司的Beclin1單克隆抗體、PBS（磷酸鹽平衡生理鹽水）、DAB（辣根過氧化物顯色試劑盒）、二甲苯及購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司的免疫組化SP染色試劑盒等。制作組織標(biāo)本的方法為：用已知直腸癌組織的切片作為陽性對照，用PBS代替一抗，并作為陰性對照。將石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，切片的厚度為4～7 μm。將組織切片經(jīng)脫蠟、水化、高壓修復(fù)后加入一抗。然后放入4℃的冰箱孵育過夜。將組織切片在37℃的環(huán)境下放置回溫后加入二抗，在37℃的溫箱中孵育30 min。用DAB對組織切片進(jìn)行染色，再用蘇木素重復(fù)染色3 min。用酒精將組織切片進(jìn)行梯度脫水干燥后，用二甲苯將其透明（透明化）10 min。將組織切片用中性樹膠密封在載玻片和蓋玻片之間，放入60℃的烘箱中烤干，獲得組織標(biāo)本。將組織標(biāo)本放在200倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1）Beclin1的表達(dá)為陽性指的是上述組織標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色顆粒。根據(jù)組織標(biāo)本被染色的深淺，將無著色的組織記為0分，將黃色的組織記為1分，將黃褐色的組織記為2分。在顯微鏡視野下，未染色的組織記0分，染色組織的占比＜10%的記1分，占比11%～50%的記2分，占比51%～75%的記3分，占比76%～100%的記4分。將上述兩項的得分相乘為總分，總分為0分表示Beclin1的表達(dá)為陰性，總分為1～4分表示Beclin1的表達(dá)為弱陽性（+），得分為5～8分表示Beclin1的表達(dá)為強(qiáng)陽性（++）。2）對這50例患者進(jìn)行5年的隨訪，觀察Beclin1表達(dá)為陽性的患者與Beclin1表達(dá)為陰性患者的總生存期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1在這50例患者結(jié)直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)

在這50例患者的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，Beclin1表達(dá)為陽性的患者有18例，為陰性的患者有32例。在Beclin1表達(dá)為陽性的患者中，Beclin1表達(dá)為強(qiáng)陽性的患者有11例，為弱陽性的患者有7例。這50例患者結(jié)直腸癌組織和正常組織中Beclin表達(dá)的陽性率分別為36%（18/50）和82%（41/50），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1和圖2。

圖1 患者癌組織中Beclin1的表達(dá)

圖2 患者正常組織中Beclin1的表達(dá)

2.2 Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

Beclin1在患者結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與其腫瘤組織浸潤的深淺、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化的程度具有相關(guān)性(P＜0.05)，與其年齡及腫瘤組織是否發(fā)生脈管侵犯不具有相關(guān)性（P＞0.05）。詳見表1。

表1 Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（n）

2.3 Beclin1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

在這50例患者中，結(jié)直腸癌組織中Beclin1表達(dá)為陰性患者的死亡率為10%（5/50），為陽性患者的死亡率為6%（3/50）。采用Kaplan-Meier生存分析法評估患者的總生存期發(fā)現(xiàn)，Beclin1表達(dá)為陽性的患者其總生存期與Beclin1表達(dá)為陰性的患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Beclin1廣泛分布于人體的組織中[3]。有研究資料顯示，癌癥患者癌組織中Beclin1的表達(dá)通常低于其正常組織[4]。將患者的癌組織進(jìn)行體外培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)beclin1的缺失可減少人體細(xì)胞的自噬。有實驗證實，與正常小鼠相比，beclin1雜合子小鼠的表型雖相近，但其腫瘤的發(fā)生率及HBV（乙型肝炎）的發(fā)生率均較高，其細(xì)胞增生較多且細(xì)胞自噬較少[5]。有資料顯示，Beclin1可抑制患者腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[6-7]。在本次研究中，筆者認(rèn)為Beclin1的表達(dá)與其腫瘤組織浸潤的深淺、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化的程度具有相關(guān)性?；颊呓Y(jié)腸癌組織中Beclin1的表達(dá)為強(qiáng)陽性表示其預(yù)后較好。筆者的觀點與研究資料的觀點基本一致。另有研究表明，Beclin1在癌組織中表達(dá)的陽性率較正常組織高[8]。這一研究結(jié)果與本文的研究結(jié)果存在差異。筆者認(rèn)為，Beclin1的表達(dá)可抑制患者結(jié)直腸癌組織的生成和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高其總生存期。本次研究的結(jié)果顯示，Beclin1在患者結(jié)直腸癌組織及正常組織中表達(dá)的陽性率分別為36%和82%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Beclin1在患者結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與其腫瘤組織浸潤的深淺、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化的程度具有相關(guān)性(P＜0.05)，與其年齡及腫瘤組織是否發(fā)生脈管侵犯不具有相關(guān)性（P＞0.05）。Beclin1表達(dá)為陽性的患者其總生存期與Beclin1表達(dá)為陰性的患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在今后的研究中，我們將通過RNA干擾技術(shù)建立Beclin1表達(dá)的模型，用來檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，以進(jìn)一步驗證Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。綜上所述，對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行Beclin1的檢測可評估其病情的進(jìn)展情況及預(yù)后。