閆婉君 張淑群

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來有發(fā)病年輕及發(fā)病率上升的趨勢，嚴重威脅著女性的身心健康，轉(zhuǎn)移是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，大量的研究表明黃芩素具有廣譜的抗腫瘤作用。SATB1(special AT rich sequence binding protein1)是一種組織特異性核基質(zhì)結(jié)合蛋白，近幾年研究SATB1在大多數(shù)實體腫瘤組織中的含量都有增加,尤其在浸潤性乳腺癌細胞中高表達。大量研究表明，EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)的發(fā)生過程和Wnt/β-catenin信號通路與乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移特征有著密切的聯(lián)系。本實驗旨在探討黃芩素(Baicalein)對人乳腺癌MDA-MB-231細胞肝轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)的作用機制是否與SATB1蛋白，EMT的發(fā)生以及Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，這將為黃芩素抗腫瘤的研究增添了新的基礎(chǔ)理論依據(jù)，為尋找安全有效的抗癌藥物提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃芩素購于美國sigma公司,溶于DMSO(美國 Sigma 公司)并避光保存于-20 ℃；羥甲基纖維素鈉購于美國sigma公司；RPMI-1640購于美國hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Amresco公司；雙抗購于西安依科生物公司。SATB1單抗、E-cadherin單抗、Snail單抗購于美國Abacom；Wnt1多克隆抗體、β-catenin單抗、Vimentin單抗購于美國Cell Signaling Technology(CST)。山羊抗兔、抗鼠購于康為公司。SP試劑盒、DAB顯色劑購于北京中杉金橋公司。PVDF膜購于Millipore(美國)。

1.2 細胞系和實驗動物

人乳腺癌細胞系MD-MB-231購于American Type Culture Collection(ATCC,USA)。BALB/c雌性小鼠24只，購于西安交通大學(xué)動物實驗中心，4～6周齡，體重為16～20 g；裸鼠飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境下，恒溫22 ℃～25 ℃，恒濕55%～56%，應(yīng)用水、飼料及實驗用品均經(jīng)滅菌、消毒處理，實驗室操作嚴格遵守?zé)o菌操作原則。

1.3 藥品配制

Baicalein用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成100 mmol/L，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃保存，使用前解凍。羥甲基纖維素鈉用蒸餾水稀釋成0.5%的溶液，4 ℃保存。灌胃前將溶解的黃芩素懸浮于羥甲基纖維素鈉溶液里。

1.4 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞在高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清及100 U/L青霉素和100 μg/L鏈霉素)，37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長的細胞用于后續(xù)試驗。

1.5 建立裸鼠模型與動物分組及給藥

取處于對數(shù)生長體外培養(yǎng)的MDA-MB-231高侵襲性乳腺癌細胞，細胞濃度調(diào)整至2×106/ml,無菌條件下，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射2×105個細胞。每隔一周觀察裸鼠的體重和健康狀況。將裸鼠隨機分為4組：空白對照組；黃芩素實驗組；黃芩素低劑量預(yù)防組；高劑量預(yù)防組,每組6只。按體重計算裸鼠給藥劑量，對照組、預(yù)防組低組和高組于注射細胞次日開始給藥。實驗組于注射細胞1個月后給藥。實驗組100 mg·(kg·d-1)，低劑量預(yù)防組50 mg·(kg· d-1)，高劑量預(yù)防組100 mg·(kg· d-1)。確定灌胃給藥，1次/d,對照組給予等體積生理鹽水灌飼，連續(xù)15天(表1)。接種細胞8周后，將各組裸鼠頸椎脫臼處死，取肝組織，分別稱其質(zhì)量。將肝組織固定于4%的多聚甲醛，48 h后在解剖顯微鏡下觀察肝組織表面灰白色結(jié)節(jié)即轉(zhuǎn)移灶和其數(shù)目(經(jīng)驗豐富的乳腺病理醫(yī)師獨立觀察標本)。

表1 藥物干預(yù)

注：a為預(yù)防組低劑量，b為預(yù)防組高劑量。

1.6 H-E染色

石蠟包埋的肝組織蠟塊，切成5 μm厚。經(jīng)二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，蘇木精染色，鹽酸乙醇水化流水沖洗，1%伊紅酒精溶液染色，蒸餾水稍洗，再經(jīng)過脫水和透明后。中性樹膠封片，進行圖像采集和分析。

1.7 免疫組化法

載玻片經(jīng)二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，檸檬酸抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，然后每張載玻片上組織滴加H2O2，37 ℃孵育20 min，滴加試劑A 37 ℃孵育15 min，然后滴加抗體SATB1(1∶100)，Wnt1(1∶200)，β-catenin(1∶100)，E-cadherin(1∶100)，Vimentin(1∶50)和 Snail(1∶80)4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min；滴加試劑B，37 ℃孵育15 min；滴加試劑C，37 ℃孵育15 min；滴加DAB室溫顯色2 min，自來水沖洗3～5 min，蘇木精復(fù)染3 min，自來水沖洗10 min，酒精脫水二甲苯透明，中性樹膠封片，應(yīng)用顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)軟件分析。主要檢測各組裸鼠肝組織中SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達。判斷指標為：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：由經(jīng)驗豐富的乳腺病理醫(yī)師獨立觀察切片。SATB1,Snail蛋白的陽性表達顯示胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至黃棕色為陽性細胞。Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin陽性表達在細胞膜和細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)染為淡黃色至棕色為陽性細胞。表達水平按照半定量法分為3級：-，無表達，染色強度與背景無明顯差別；+,陽性細胞率<50%，染色強度介于兩者之間；++，陽性細胞率>50%,染色強多數(shù)細胞呈黃色至棕黃色[1]。

1.8 Western blot

按照RIPA裂解液組提取肝組織蛋白，測定蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，快速降至室溫后上樣，進行SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度5%，電壓80 V，分離膠濃度10%，電壓120 V。溴酚藍剛跑至凝膠最低端即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜激活后使用5%的脫脂奶粉或者5%BSA的TBST溶液中室溫封閉2 h后,TBST洗膜一次15 min，孵育一抗SATB1(1∶1 000)，Wnt1(1∶1 000)，β-catenin(1∶1 000)，E-cadherin(1∶1 000)，Vimentin(1∶1 000)，Snail(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，孵育二抗(1∶5 000)，室溫1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL發(fā)光液A∶B=1∶1混合，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Syngene 英國)曝光。實驗重復(fù)3次。用Image-Pro Plus 6.0軟件凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值，其比值表示蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SSPS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組計量資料的比較采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝組織的大體標本和H-E染色

經(jīng)尾靜脈注射腫瘤細胞后，小鼠體質(zhì)穩(wěn)定，狀態(tài)良好。4%多聚甲醛固定48 h后肝組織的大體標本，于體視顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)對照組的肝組織有少量的轉(zhuǎn)移灶，實驗組和預(yù)防組未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶；對照組可見微小轉(zhuǎn)移灶，在實驗組和預(yù)防組未見明顯的微小轉(zhuǎn)移灶。

2.2 免疫組化結(jié)果

SATB1、Wnt1、β-catenin、Vimentin、Snail在對照組肝組織中顯著表達(P<0.05)，在實驗組和預(yù)防組中表達降低；E-cadherin在對照組肝組織中表達降低，而在實驗組和預(yù)防組表達升高。各抗體的表達抑制率具體結(jié)果見表2。各組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 Western blot 結(jié)果

結(jié)果分析(圖1)肝組織SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達水平，膠片掃描儀采集圖片。Image-Pro Plus 6.0測量蛋白條帶灰度值，并分別以SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail的目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值得比值作為蛋白的相對表達量(表3)。結(jié)果顯示實驗組與對照組；預(yù)防組低劑量和預(yù)防組高劑量SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail各蛋白表達水平與對照組比較均有顯著性差異，其中實驗組和預(yù)防組中SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail蛋白表達水平與對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin蛋白表達水平與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組蛋白的表達抑制率

注：與對照組相比,a為P<0.05。

表3 各組蛋白的相對表達量/%

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[2-3]，而轉(zhuǎn)移是乳腺癌進展的最后階段，同時也是乳腺癌患者高死亡率的主要原因[4]，導(dǎo)致超過90%癌癥患者死亡。正常的乳腺上皮細胞通過一系列連續(xù)的變化包括細胞基因和遺傳表觀的改變與微環(huán)境的相互作用而發(fā)生惡變、侵襲、轉(zhuǎn)移[5]。目前對于轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制尚未完全清楚。尋找有效的毒副作用小的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物，對提高乳腺癌療效、改善預(yù)后、提高生存質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。中藥黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在體內(nèi)外有廣泛的抗腫瘤的作用[6-10]，因此本實驗研究主要在于發(fā)現(xiàn)黃芩素抑制乳腺癌細胞肝轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)的作用機制。

國外大量的研究已經(jīng)表明，SATB1作為“基因組組織者”調(diào)控大量轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并且在浸潤性乳腺癌高表達和促進肺骨等遠處轉(zhuǎn)移[11]。Wnt/β-catenin信號通路也參與乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)SATB1調(diào)控的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如c-myc和bcl-2同時也被Wnt/β-catenin信號通路所調(diào)控，表明Wnt/β-catenin信號通路和SATB1之間有功能上的重疊作用。此外，在乳腺癌中SATB1通過調(diào)節(jié)β-catenin并與其相互作用，進而β-catenin結(jié)合到SATB1的作用靶位點[12]。研究同時也發(fā)現(xiàn)其與EMT的發(fā)生密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，EMT是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期的一個重要的過程。因此，我們可以假設(shè)黃芩素使通過下調(diào)SATB1的表達，阻止Wnt/β-catenin的信號通路，從而阻止EMT的發(fā)生，進而阻止乳腺癌的轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Gao等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞中SATB1蛋白的表達，且呈濃度依賴性，因此黃芩素可通過抑制SATB1蛋白的表達而發(fā)揮抗乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移作用。Chung等[13]的研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在乳腺癌細胞中抑制EMT形成的發(fā)生。并且有學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)上皮的標志物如：E-cadherin 和catenin的減少或者丟失可能與乳腺癌的遠處器官和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。Matsuda等研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路影響乳腺癌細胞MDA-MB-231的多個生物學(xué)性質(zhì)。Smith等[14]研究發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌細胞 (MDA-MB-231)中ERK2通過Snail的同種型激活導(dǎo)致EMT的發(fā)生與細胞的遷移增加和黏附減少相關(guān)。Vimentin 被稱為EMT的標志物，高表達反應(yīng)了晚期乳腺癌的高浸潤性和耐藥性。E-cadherin作為上皮的重要標志物，ElMoneim等[15]研究發(fā)現(xiàn)浸潤性導(dǎo)管癌患者的病情的進展和預(yù)后的重要的特點即E-cadherin的減少。E-cadherin減少可能的機制為與染色質(zhì)重組，甲基化及改建相關(guān)。在浸潤性導(dǎo)管癌和各類乳腺癌細胞中，轉(zhuǎn)錄水平中CDH1啟動子的甲基化和5 CpG區(qū)的重疊被驗證與E-cadherin表達的丟失相關(guān)。因其缺乏動物實驗的數(shù)據(jù)的驗證，只能在體外發(fā)揮其作用，因此本實驗通過黃芩素體內(nèi)實驗的驗證，通過建立乳腺癌裸鼠模型，實驗免疫組化結(jié)果為SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達在對照組表達(++/+)，實驗組表達(-/+-)，預(yù)防組低劑量(+)和預(yù)防組高劑量(+/+-)；E-cadherin在對照組表達(-)，實驗組表達(+)，預(yù)防組低劑量(+)預(yù)防組高劑量(++)。Western blot 結(jié)果為黃芩素下調(diào)SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達和上調(diào)E-cadherin蛋白的表達。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗P<0.05，各組蛋白表達水平均有顯著的差異。本實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芩素下調(diào)乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白如SATB1，Wnt1,β-catenin,Vimentin,Snail和上調(diào)E-cadherin的表達的影響。因此黃芩素抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移可能機制是通過抑制SATB1蛋白的表達和EMT的發(fā)生，阻止Wnt1/β-catenin信號通路，從而減少乳腺癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。進一步的驗證還需在其他乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路和基因的水平驗證SATB1、Wnt/β-catenin信號通路和EMT三者相互關(guān)系與作用在乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移的研究。本研究設(shè)計的不足之處是未設(shè)立陽性對照，希望后續(xù)實驗設(shè)計研究中考慮并進一步的驗證本實驗的結(jié)果。

目前的相關(guān)研究表明，中藥黃芩素的研究僅停留在基礎(chǔ)研究階段，尚未開展與臨床相關(guān)的研究。本研究為黃芩素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究和開展臨床試驗增添了新的基礎(chǔ)理論依據(jù)，為尋找安全有效的抗癌藥物提供了新的思路。