劉燚，張金龍，孫郁雨，崔志明

(南通市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 南通 226000)

隨著社會(huì)科技的發(fā)展和進(jìn)步，交通、施工等變得越來(lái)越便利的同時(shí)，外傷事故的發(fā)生率也隨之增加。其中肢體損傷占很大的比例，而骨筋膜室綜合征則是其中比較嚴(yán)重的創(chuàng)傷疾病之一[1]。眾所周知，骨筋膜室綜合征一旦延誤治療，輕者肌肉神經(jīng)損傷、功能受損，重者需要截肢，甚至死亡。因此，早期診斷、早期治療、早期康復(fù)已經(jīng)成為治療骨筋膜室綜合征的共識(shí)。然而，目前大家的關(guān)注點(diǎn)多集中在早期手術(shù)切開減壓等治療方面，對(duì)神經(jīng)損傷的早期治療和預(yù)防關(guān)注不多。本研究通過(guò)建立兔的骨筋膜室綜合征的動(dòng)物模型，通過(guò)兔腿間隔筋膜室內(nèi)壓力動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，兔后腿神經(jīng)標(biāo)本的HE染色、免疫熒光等方法明確神經(jīng)損傷的變化情況，并早期局部應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)進(jìn)行干預(yù)，探求使用NGF早期預(yù)防和治療骨筋膜室綜合征神經(jīng)損傷的時(shí)機(jī)和療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)于2016年9月至2017年12月在南通大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室北區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成。健康成年新西蘭兔24只，雌雄不限，體重(2.5±0.3)kg(由南通大學(xué)動(dòng)物中心提供)，自由進(jìn)食顆粒狀飼料及飲用自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度20～23℃，相對(duì)濕度55%～65%。試劑分別來(lái)自abcam、cell signaling等。

1.2 設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者 設(shè)計(jì)為全部作者，干預(yù)實(shí)施為第一作者和第二作者，評(píng)估為全部作者，均受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，采用非盲法評(píng)估。

1.3 方法 動(dòng)物模型制備：參照Aydin F等[2]使用的“止血帶”法建立兔骨筋膜室綜合征動(dòng)物模型。模型制作前準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)兔禁食12 h，禁飲4 h。麻醉藥物：烏拉坦(200 g/L)，使用劑量：5 mL/kg，注射方式：耳緣靜脈緩慢注射麻醉，注射速度：10 mL/15 min。操作前半小時(shí)予以兔后腿備皮，使用簡(jiǎn)易監(jiān)測(cè)儀觀察實(shí)驗(yàn)兔的基本生命體征。模型制作：止血帶加壓環(huán)扎實(shí)驗(yàn)兔已備皮的后腿，在止血帶外再使用血壓器袖帶充氣加壓，固定8 h后松解止血帶，兔后腿出現(xiàn)明顯腫脹，骨筋膜室綜合征動(dòng)物模型制作成功。

1.4 兔腿間隔筋膜室內(nèi)壓力測(cè)定 使用Whiteside針刺裝置監(jiān)測(cè)小腿部骨筋膜室內(nèi)壓。操作前需準(zhǔn)備物品：普通汞柱血壓表、三通管、普通針頭、注射器、生理鹽水。具體操作：將血壓表與三通管、針頭、注射器連接完畢。將血壓表與實(shí)驗(yàn)兔被測(cè)后腿放在同一平面。針頭刺入兔腿脛前筋膜間隙內(nèi)(注意不要刺入肌肉中)，注射器抽取空氣通過(guò)三通管推入，同時(shí)注入少許生理鹽水(保證針頭在間隙內(nèi)通暢而不被周圍組織所阻塞)，三通管連接血壓計(jì)后測(cè)量，即可顯示實(shí)驗(yàn)兔腿的脛前筋膜室內(nèi)壓。

1.5 Western blot 切除新鮮的組織標(biāo)本，并進(jìn)行組織蛋白的提取，之后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離組織蛋白質(zhì)，行轉(zhuǎn)膜印跡，待完全冷卻后，將轉(zhuǎn)印膜行麗春紅染色30 s，然后dd H2O脫色2 min。最后行蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)。掃描生物圖像處理系統(tǒng)測(cè)定灰度、分析圖像、量化灰度，然后進(jìn)行分析，相同條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以減小誤差。

1.6 HE染色分析

1.6.1 組織石蠟包埋切片 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上。將組織從固定液取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75%酒精4 h，85%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精1 h，無(wú)水乙醇Ⅰ 30 min，無(wú)水乙醇Ⅱ 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯Ⅰ 5～10 min，二甲苯Ⅱ 5～10 min，蠟Ⅰ 1 h，蠟Ⅱ 1 h，蠟Ⅲ 1 h。將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出，按照包埋面要求放入包埋框，并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于-20℃凍臺(tái)冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，片厚4μm。切片漂浮于攤片機(jī)40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進(jìn)60℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干、蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 HE染色 依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ 20 min，無(wú)水乙醇Ⅰ 10 min，無(wú)水乙醇Ⅱ 10 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水洗。切片入Harris蘇木素染3～8 min，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min。將切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min，95%酒精Ⅱ 5 min，無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min，無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1.7.1 冰凍切片制片 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上。將組織從固定液取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整。將修切好的組織放于15%的蔗糖溶液內(nèi)4°℃冰箱脫水沉底后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底。將脫好水的組織取出，用濾紙將表面水稍吸干后切面朝上放于包埋臺(tái)上，組織周圍滴上OCT包埋劑，將包埋臺(tái)放在冰凍切片機(jī)的速凍臺(tái)上速凍包埋，OCT變白變硬后即可進(jìn)行切片。將包埋臺(tái)固定于切片機(jī)上，先粗切，將組織面修切平整后即可開始切片，切片厚度為8～10 μm。將干凈的載玻片平放于切出的組織片上方即可將組織貼于載玻片上。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 切片染色 新鮮組織固定于4%多聚甲醛24 h以上；將組織從固定液取出，在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整。將修切好的組織放于15%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液內(nèi)4℃冰箱脫水沉底。將脫好水的組織取出，用濾紙將表面水稍吸干后切面朝上放于包埋臺(tái)上，組織周圍滴上OCT包埋劑，將包埋臺(tái)放在冰凍切片機(jī)的速凍臺(tái)上速凍包埋，OCT變白變硬后即可進(jìn)行切片。將包埋臺(tái)固定于切片機(jī)上，先粗切，將組織面修切平整后即可開始切片，切片厚度8～10 μm。將干凈的載玻片平放于切出的組織片上方即可將組織貼于載玻片上。-20℃保存?zhèn)溆谩?%冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍；與二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS洗3遍；一抗4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜，PBS洗3遍；二抗室溫2 h(避光)，PBS洗3遍；用DAPI染核10 min，PBS洗3遍，然后直接照熒光片。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分析 納入動(dòng)物數(shù)量24只，均進(jìn)入結(jié)果分析，沒有脫落。

2.2 脛前筋膜室內(nèi)壓監(jiān)測(cè)情況 正常組兔腿筋膜室壓力為(0.38±0.1)kPa，實(shí)驗(yàn)組兔腿傷后4 h筋膜室壓力為(2.0±0.2)kPa，傷后8 h為(4.3±0.4)kPa，傷后1 d為(7.0±0.4)kPa，傷后3d為(4.9±0.3)kPa，傷后5 d為(4.5±0.3)kPa，傷后7d為(4.0±0.3 )kPa，傷后2周為(2.9±0.3)kPa，傷后4周為(0.6±0.1)kPa。結(jié)果示實(shí)驗(yàn)兔腿與正常兔腿的筋膜室壓力間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在模型成功后實(shí)驗(yàn)兔后腿的筋膜室內(nèi)壓明顯上升，在1 d時(shí)，筋膜室壓力達(dá)到峰值，之后筋膜室壓力逐漸下降(P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

2.3 兔骨筋膜室綜合征神經(jīng)損傷后細(xì)胞增殖核抗原的變化 我們運(yùn)用Western blot技術(shù)觀察兔骨筋膜室綜合征后PCNA時(shí)間依賴性表達(dá)，PCNA在對(duì)照組呈現(xiàn)出低表達(dá)，在兔骨筋膜室綜合征4 h后開始上調(diào)，5 d時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐漸下降(見圖1)。這些結(jié)果表明PCNA蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)是由于骨筋膜室綜合征損傷誘導(dǎo)所致。

a Western blot結(jié)果

注：*代表與sham組(對(duì)照組)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 局部早期應(yīng)用NGF治療神經(jīng)損傷的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 為了分析局部早期應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子神經(jīng)組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的變化，我們運(yùn)用石蠟組織切片進(jìn)行HE染色來(lái)分析兔骨筋膜室綜合征神經(jīng)損傷后的病理學(xué)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未注射NGF組在損傷后5 d，可見神經(jīng)纖維斷裂、水腫、空泡、形狀不規(guī)則的組織形態(tài)，而給予NGF注射的實(shí)驗(yàn)組在同一時(shí)間點(diǎn)的組織形態(tài)要明顯好于未注射組(見圖2)。此實(shí)驗(yàn)逐步表明，在早期給予NGF注射可對(duì)兔骨筋膜室綜合征神經(jīng)損傷有一定的修復(fù)作用。

2.5 免疫熒光雙標(biāo)分析注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子后不同的細(xì)胞標(biāo)記物熒光的共表達(dá) 進(jìn)一步明確注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)兔骨筋膜室綜合征后與神經(jīng)的恢復(fù)以及施旺細(xì)胞表達(dá)的狀況影響，我們運(yùn)用免疫熒光技術(shù)取正常組和實(shí)驗(yàn)組病變部位神經(jīng)組織進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。施旺細(xì)胞是外周神經(jīng)中的特異性細(xì)胞，與外周神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和增殖有密切聯(lián)系。因此，考慮選擇施旺細(xì)胞作為檢測(cè)指標(biāo)。分別用S100、DAPI標(biāo)記施旺細(xì)胞以及細(xì)胞核，我們可以發(fā)現(xiàn)給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠明顯增加兔骨筋膜室綜合征后神經(jīng)細(xì)胞增殖數(shù)量，而通過(guò)熒光雙標(biāo)顯示，給予NGF注射后，S100和DAPI共標(biāo)明顯增加。損傷5 d時(shí)，相對(duì)于對(duì)照組和未注射NGF組，NGF注射組中S100、DAPI的表達(dá)均明顯增加(見圖3)，而且兩者共標(biāo)亦明顯增加，表明兔骨筋膜室綜合征后注射NGF，明顯促進(jìn)了施旺細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。

a 對(duì)照組(×40) b 未注射NGF組(×40) c 注射NGF組(×40)

d 對(duì)照組(×200) e 未注射NGF組(×200) f 注射NGF組(×200)

圖2 實(shí)驗(yàn)兔(對(duì)照組)、損傷后5 d(損傷未注射組)、損傷后5 d(損傷注射組)的兔后腿神經(jīng)標(biāo)本HE染色

a 對(duì)照組 b 未注射NGF組 c 注射NGF組

注：S100-綠色；DAPI-藍(lán)色

圖3 損傷后神經(jīng)細(xì)胞和施旺細(xì)胞的共定位情況(×200)

3 討 論

骨筋膜室綜合征是四肢創(chuàng)傷中最為嚴(yán)重的疾病之一，多發(fā)生于四肢骨折后，少數(shù)無(wú)骨折僅軟組織嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)也可形成，血管損傷、燒傷、醫(yī)源性損傷等均可引起。創(chuàng)傷后患肢肌肉、軟組織劇烈腫脹，致使骨筋膜的間隔膨脹，間隔壓力快速升高，肌肉、神經(jīng)組織受壓，繼而出現(xiàn)張力性水皰、肌張力增高、肌肉大面積壞死、肢體感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙等，嚴(yán)重時(shí)甚至引起多器官功能衰竭而導(dǎo)致死亡。因此，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)手術(shù)是預(yù)防和治療骨筋膜室綜合征的重中之重。骨筋膜室綜合征后神經(jīng)損傷的出現(xiàn)概率較高，出現(xiàn)的時(shí)間也比較早，而目前判斷神經(jīng)損傷的方法多為肢體感覺運(yùn)動(dòng)情況的檢查，并沒有具體客觀的檢查指標(biāo)，而且神經(jīng)損傷的治療方法也很有限，尤其是神經(jīng)損傷的早期治療多被忽視。本實(shí)驗(yàn)的目的就是通過(guò)骨筋膜室綜合征動(dòng)物模型研究早期神經(jīng)損傷的時(shí)間、治療以及療效等。

動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)兔腿筋膜室壓力的動(dòng)態(tài)測(cè)量，我們發(fā)現(xiàn)松開止血帶后筋膜室壓力隨之升高，在1 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。我們運(yùn)用Western blot技術(shù)觀察兔骨筋膜室綜合征后PCNA時(shí)間依賴性表達(dá)，PCNA在對(duì)照組呈現(xiàn)出低表達(dá)，在兔骨筋膜室綜合征4 h后開始上調(diào)，5 d時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰(P<0.05)，然后，PCNA逐漸下降。這些結(jié)果表明PCNA蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)是由于骨筋膜室綜合征損傷誘導(dǎo)所致。實(shí)驗(yàn)表明骨筋膜室綜合征早期即會(huì)引起神經(jīng)損傷，并且在短期內(nèi)會(huì)達(dá)到損傷的高峰。我們?cè)龠\(yùn)用石蠟組織切片進(jìn)行HE染色來(lái)分析兔骨筋膜室綜合征神經(jīng)損傷后的病理學(xué)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷后5 d，可見神經(jīng)纖維斷裂、水腫、空泡、形狀不規(guī)則的組織形態(tài)；而給予NGF注射的實(shí)驗(yàn)組在同一時(shí)間點(diǎn)的組織形態(tài)要明顯好于未注射組。HE染色結(jié)果提示早期局部使用NGF對(duì)于神經(jīng)損傷的預(yù)防和修復(fù)具有明顯的效果。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，施旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是外周神經(jīng)系統(tǒng)具有特異性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[3-4]，在神經(jīng)損傷后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用。施旺細(xì)胞可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)分子，形成周圍神經(jīng)再生的微環(huán)境，指導(dǎo)和支持神經(jīng)的增殖和遷移[5]。周圍神經(jīng)損傷后，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)后形成炎癥反應(yīng)，清除碎片并調(diào)節(jié)微環(huán)境以允許有效的再生[6]。施旺細(xì)胞與巨噬細(xì)胞合作，通過(guò)某些受體介導(dǎo)的吞噬作用以及自噬來(lái)清除髓鞘碎片，在體內(nèi)獲得抗原呈遞功能并調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)和周圍神經(jīng)疾病[7-8]。施旺細(xì)胞通過(guò)支持軸突生長(zhǎng)和髓鞘形成在外周神經(jīng)修復(fù)和再生中起關(guān)鍵作用[9-12]，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)再生能力不可或缺的部分[12-13]。迄今為止，施旺細(xì)胞被認(rèn)為是用于周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷或退行性疾病的活細(xì)胞療法的最有希望的候選者[14]。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和促神經(jīng)生長(zhǎng)的功能。它不僅僅作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)也在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15]。既然NGF和施旺細(xì)胞均在神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，那么兩者之間是否存在一定的聯(lián)系？

為了進(jìn)一步明確注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)兔骨筋膜室綜合征后對(duì)神經(jīng)的恢復(fù)以及施旺細(xì)胞表達(dá)的狀況影響。我們運(yùn)用免疫熒光技術(shù)取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組病變部位神經(jīng)組織進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。S100存在于培養(yǎng)的施旺細(xì)胞中并且可能對(duì)周圍神經(jīng)損傷發(fā)揮旁分泌作用，是施旺細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[16]。分別用S100、DAPI標(biāo)記施旺細(xì)胞以及細(xì)胞核，我們可以發(fā)現(xiàn)給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠明顯增加兔骨筋膜室綜合征后神經(jīng)細(xì)胞增殖數(shù)量，而通過(guò)熒光雙標(biāo)顯示，給予NGF注射后，S100和DAPI共標(biāo)明顯增加，表明兔骨筋膜室綜合征后早期局部注射NGF可以促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖。施旺細(xì)胞的增殖可以促進(jìn)髓鞘修復(fù)，誘導(dǎo)軸突再生，加速神經(jīng)元的生長(zhǎng)和修復(fù)，同時(shí)一定程度抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，避免神經(jīng)受損進(jìn)一步加重。

骨筋膜室綜合征的處理應(yīng)著重于早期預(yù)防、早期診斷以及早期治療。在臨床治療的同時(shí)，需要密切監(jiān)測(cè)患肢神經(jīng)的情況，對(duì)于早期可能會(huì)出現(xiàn)或者已經(jīng)出現(xiàn)神經(jīng)損傷表現(xiàn)的，早期連續(xù)局部注射NGF的治療方法給廣大醫(yī)務(wù)工作者提供了一個(gè)選擇。同時(shí)臨床實(shí)際應(yīng)用中存在著許多的不可預(yù)知性，藥品的來(lái)源、給藥技術(shù)、療效評(píng)估、起效時(shí)間、不良反應(yīng)、醫(yī)源性損傷等方面均需要進(jìn)一步的研究。但是我相信本實(shí)驗(yàn)不僅提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，更為臨床治療提供了新的理論和技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。