馮連榮，彭儒勝，周宏民，趙鑫聞，張妍，梁德軍，田云峰

(1.遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213；2.新疆塔城地區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所，新疆 塔城 834700)

楊樹是新疆塔城地區(qū)最主要的造林樹種之一，在防護(hù)林和商品林的建設(shè)中占有重要地位。塔城地區(qū)現(xiàn)有林地總面積189.33×104hm2，其中生態(tài)林2.31×104hm2，絕大多數(shù)是楊樹。塔城地區(qū)種植的楊樹品種主要有俄羅斯楊(Populusrusskii)、鉆天楊(P.nigravar.italica)、新疆楊(P.albavar.pyramidalis)、北美楊OP-367、銀×新楊(P.alba×P.albavar.pyramidalis)、銀白楊(P.alba)、07-628楊等品種，其中以俄羅斯楊為主，占到所有楊樹品種90%以上，其他品種都為零星種植。俄羅斯楊是由鉆天楊與歐洲黑楊(P.nigra)雜交獲得的雜交種，具有抗寒、抗旱、耐高溫等抗逆特性[1]。1988年在新疆維吾爾自治區(qū)以楊樹人工基因庫優(yōu)良品種予以鑒定[2]，是目前新疆干旱區(qū)防風(fēng)治沙的主要樹種之一。20世紀(jì)90年代俄羅斯楊被引入塔城地區(qū)，得到大面積推廣并迅速取代原有楊樹品種，隨著種植面積的擴(kuò)大，物種多樣性降低、生態(tài)防護(hù)效能下降，極易發(fā)生病蟲害。自2010年以來，塔城地區(qū)各級(jí)林業(yè)單位開始報(bào)道楊樹樹皮有發(fā)黑的情況，表現(xiàn)為樹干下部發(fā)黑，樹皮裂縫、粗糙處及疤痕處尤為嚴(yán)重，遠(yuǎn)望如同火燒，且發(fā)病面積呈逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)，截至2015年初，塔城地區(qū)各縣(市)均發(fā)現(xiàn)有楊樹樹皮發(fā)黑情況。塔城地區(qū)林科所先對(duì)塔城盆地防護(hù)林進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示塔城地區(qū)所有俄羅斯楊樹林地均不同程度感病，發(fā)病面積達(dá)2×104hm2，對(duì)塔城地區(qū)生態(tài)建設(shè)帶來毀滅性的災(zāi)害。

本文在研究俄羅斯楊該枝干病害進(jìn)行病原菌分離時(shí)分離獲得一株鏈格孢屬真菌。鏈格孢屬(Alternaria)真菌是全球分布最廣，經(jīng)濟(jì)上重要的半知菌類真菌之一[3]。95%以上的種類兼性寄生于植物上，引起多種植物病害，能廣泛引起農(nóng)作物的多種病害及果蔬貯藏期間的腐爛變質(zhì)，造成全球性的田間和產(chǎn)后巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。因其可能為潛在的病原菌，筆者對(duì)該菌種進(jìn)行了形態(tài)和ITS鑒定，并對(duì)該菌進(jìn)行了常用的殺菌劑敏感性測(cè)定，以期為以后防治該鏈格孢屬真菌引起的病害提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)自然概況

病害樣本采集自新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)。塔城地區(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)西北部，地處82°16′-87°21′E、43°25′-47°15′N之間。塔城地區(qū)屬干旱半干旱大陸性氣候，多風(fēng)少雨，冷暖波動(dòng)大，年平均降水量142-295mm，年平均氣溫5-7℃，年極端最高溫40℃，極端最低溫-40℃，地方性小區(qū)氣候比較明顯。全區(qū)無霜期一般為150-180d，年均日照時(shí)數(shù)2 832.0-3 006.0h[5]。

1.2 材料與藥劑

供試病害樣本為5年生俄羅斯楊樹干。

化學(xué)農(nóng)藥 80%代森錳鋅可濕性粉劑(陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司)、10%多抗霉素可濕性粉劑(績溪農(nóng)華生物科技有限公司)、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇省江陰市農(nóng)藥二廠有限公司)、65%代森鋅可濕性粉劑(河北青園農(nóng)藥有限公司)和50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省無錫市錫南農(nóng)藥有限公司)。

生化試劑 TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；TaqDNA Polymerase購自Thermo公司；引物采用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3’)，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，pH自然，121℃，0.1MPa高壓滅菌20min，備用。

1.3 菌種分離及鑒定

1.3.1 菌種分離與培養(yǎng)

采用組織分離法進(jìn)行菌種分離[6-7]，取滅菌培養(yǎng)皿1個(gè)，加入25%乳酸1-2滴，將熔化冷至45℃左右的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)使成平面。選擇新鮮樹皮組織用剪刀或解剖刀切取邊長約3-5mm病組織數(shù)塊，在70%酒精中浸10s，移入0.1%升汞液中消毒1-3min，滅菌水中連續(xù)漂洗3次。將病組織小塊移至培養(yǎng)基平面上，每培養(yǎng)皿內(nèi)可放2-3塊，置于26-28℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，3-4d后觀察結(jié)果。

1.3.2 菌種形態(tài)鑒定

采用玻片培養(yǎng)法，對(duì)分離的菌種進(jìn)行菌絲和孢子形態(tài)觀察。將分離獲得的純種菌絲標(biāo)記為HP，用直徑為6mm的打孔器打取菌絲圓片，接種在培養(yǎng)皿中心位置，將處理好的無菌的蓋玻片斜插到平板中約呈45°，每皿插入2片，待菌絲長到蓋玻片中央時(shí)，用鑷子輕輕將蓋玻片抽出，蓋玻片中有菌絲的一面朝上，用OLYMPUS BX 51顯微鏡鏡檢，拍照。

1.3.3 菌種ITS-PCR鑒定

(1)菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測(cè) 分離得到的菌種HP接種到PDA平板培養(yǎng)基中，25℃下靜置培養(yǎng)7d后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒及相關(guān)方法進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作方法按說明書進(jìn)行，提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。?μL提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Syngene G:BOX凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

(2)ITS-PCR及序列分析 以基因組DNA為模板，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS-PCR擴(kuò)增體系為：10PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物(10mmol/L)0.5μL，rTaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板DNA 1μL，用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度在4℃。反應(yīng)結(jié)束后取6μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)構(gòu)登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.4 室內(nèi)抑菌藥劑篩選

采用生長速率抑制法[8]測(cè)定藥劑對(duì)菌株的抑制效果，制備含不同稀釋倍數(shù)藥劑的PDA平板，用直徑為6mm的打孔器打取培養(yǎng)好的菌絲餅接種至含藥平板的中央，置于25℃進(jìn)行培養(yǎng)，待對(duì)照長滿整個(gè)平皿時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，每個(gè)濃度處理重復(fù)3次，以無藥劑處理作為對(duì)照。藥劑濃度設(shè)置為，80%代森錳鋅可濕性粉劑：400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、800倍液、900倍液、1 000倍液、1 200倍液、1 600倍液；10%多抗霉素可濕性粉劑：800倍液、1 000倍液、1 200倍液、1 400倍液、1 600倍液、1 800倍液、2 100倍液、2 500倍液、3 200倍液；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑：700倍液、800倍液、900倍液、1 000倍液、1 100倍液、1 200倍液、1 300倍液、1 500倍液、1 700倍液；65%代森鋅可濕性粉劑：200倍液、300倍液、400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、900倍液、1 200倍液、1 800倍液；50%多菌靈可濕性粉劑：200倍液、300倍液、400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、900倍液、1 200倍液、1 800倍液。

培養(yǎng)結(jié)束后利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算相對(duì)抑菌率[4]。

相對(duì)抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)÷(對(duì)照菌落直徑-0.6)×100%。

將抑菌率轉(zhuǎn)換成抑菌機(jī)率值(y)，殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值(x)根據(jù)殺菌劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與抑菌機(jī)率值，得出不同殺菌劑對(duì)供試菌株的毒力回歸方程y=ax+b，數(shù)據(jù)整理應(yīng)用Excel軟件，毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種菌落形態(tài)

經(jīng)過組織分離及兩次純化獲得了純種菌絲HP，HP在PDA上的菌落特征表現(xiàn)為：25℃培養(yǎng)7d左右菌落直徑可達(dá)7-9cm，生長速度快，菌落平展，絨毛狀，厚實(shí)，菌落邊緣整齊，初時(shí)菌落灰白色，后顏色變?yōu)樯钌?灰綠色)，可產(chǎn)生色素，背面藍(lán)黑色至黑色，有同心輪紋，見圖1。

圖1 HP菌種分離及菌落特征

2.2 菌種形態(tài)觀察

經(jīng)OLYMPUS BX 51顯微鏡檢，HP菌絲單生或有分枝，有隔，有索狀聯(lián)合。分生孢子梗直立或彎曲，分生孢子黃褐色，倒棒狀、倒梨形或橢圓形，臍部明顯。具有若干橫、縱隔膜，分隔處平滑或縊縮，根據(jù)《真菌分類學(xué)》[9]初步判斷為鏈格孢屬真菌，見圖2。

圖2 HP菌絲和孢子顯微形態(tài)

2.3 菌絲DNA提取及ITS-PCR擴(kuò)增

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖3)，DNA條帶清晰、較明亮，可以作為PCR反應(yīng)的模板。以DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對(duì)rDNAITS區(qū)段PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示片段大小約為600bp(圖4)。

圖3 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 序列相似性搜索

rDNA ITS區(qū)段序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為540bp(圖4)。測(cè)序結(jié)果登錄NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn搜索，序列與登錄號(hào)KP900243.1(Alternariaalternata)、KJ173524.1(Alternariaalternate)的菌種覆蓋度(Query cover)達(dá)100%，相似性(Ident)達(dá)99%，結(jié)合菌種的形態(tài)確定該菌為Alternariaalternate(鏈格孢菌)。鏈格孢菌屬于半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科、鏈格孢屬(Alternaria)。

2.5 室內(nèi)藥劑篩選

5種殺菌劑室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果見表1。由表1可以看出，5種藥劑隨著藥劑處理濃度的增加對(duì)HP的抑制率均相應(yīng)地提高。其中多抗霉素抑菌率為70.42%-100%，在800-1 200倍液可完全抑制鏈格孢菌的生長，抑菌率達(dá)100%，致死中濃度EC50=0.035 1mg/mL；代森錳鋅抑菌率在70.36%-90.68%，致死中濃度EC50=0.280 5mg/mL；代森鋅抑菌率在46%-85%，致死中濃度EC50=0.502 2mg/mL；甲基硫菌靈和多菌靈抑菌率不高，基本在20%-30%左右；致死中濃度EC50分別為3.751 9mg/mL和11.008 5mg/mL。

圖4 rDNA ITS擴(kuò)增電泳圖

3 結(jié)論與討論

鏈格孢屬真菌是以細(xì)鏈格孢A.tenuissima為模式種建立起來的真菌屬[11]。該屬形態(tài)特征鮮明，易于辨認(rèn)，但在不同的培養(yǎng)條件下，其分生孢子大小、隔膜、形狀和顏色等種間變異性大，造成種級(jí)分類鑒定困難[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核糖體(rDNA)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間(ITS)、延伸因子1-α(TEF1或EF1-α)、肌動(dòng)蛋白(ACT)等在鏈格孢菌鑒定中廣泛應(yīng)用[12]。ITS(Internal transcribed spacer)是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間高度特異[10]，ITS序列通過與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，序列相似性99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為95%-99%，可以鑒別為相同屬[13]。本研究通過分離菌種的形態(tài)特征結(jié)合ITS序列鑒定，確定從俄羅斯楊上分離的菌種為鏈格孢菌。

表1 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果

鏈格孢菌可以引起楊樹葉枯病[14]、棗果黑斑病[12]、核桃枯葉病[15]、鐵皮石斛枯梢病[16]及多種農(nóng)作物病害，作為潛在的致病菌，有必要進(jìn)行藥劑篩選試驗(yàn)。本研究通過5種藥劑對(duì)HP菌絲抑菌性試驗(yàn)，結(jié)果表明：10%多抗霉素對(duì)供試菌株毒力最強(qiáng)，致死中濃度(EC50)值為0.035 1mg/mL，其他依次為80%代森錳鋅、65%代森鋅、50%多菌靈和70%甲基硫菌靈，可以將10%多抗霉素作為防治HP的首選藥劑。