馮連榮,彭儒勝,周宏民,趙鑫聞,張妍,梁德軍,田云峰
(1.遼寧省楊樹研究所,遼寧 蓋州 115213;2.新疆塔城地區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所,新疆 塔城 834700)
楊樹是新疆塔城地區(qū)最主要的造林樹種之一,在防護(hù)林和商品林的建設(shè)中占有重要地位。塔城地區(qū)現(xiàn)有林地總面積189.33×104hm2,其中生態(tài)林2.31×104hm2,絕大多數(shù)是楊樹。塔城地區(qū)種植的楊樹品種主要有俄羅斯楊(Populusrusskii)、鉆天楊(P.nigravar.italica)、新疆楊(P.albavar.pyramidalis)、北美楊OP-367、銀×新楊(P.alba×P.albavar.pyramidalis)、銀白楊(P.alba)、07-628楊等品種,其中以俄羅斯楊為主,占到所有楊樹品種90%以上,其他品種都為零星種植。俄羅斯楊是由鉆天楊與歐洲黑楊(P.nigra)雜交獲得的雜交種,具有抗寒、抗旱、耐高溫等抗逆特性[1]。1988年在新疆維吾爾自治區(qū)以楊樹人工基因庫優(yōu)良品種予以鑒定[2],是目前新疆干旱區(qū)防風(fēng)治沙的主要樹種之一。20世紀(jì)90年代俄羅斯楊被引入塔城地區(qū),得到大面積推廣并迅速取代原有楊樹品種,隨著種植面積的擴(kuò)大,物種多樣性降低、生態(tài)防護(hù)效能下降,極易發(fā)生病蟲害。自2010年以來,塔城地區(qū)各級(jí)林業(yè)單位開始報(bào)道楊樹樹皮有發(fā)黑的情況,表現(xiàn)為樹干下部發(fā)黑,樹皮裂縫、粗糙處及疤痕處尤為嚴(yán)重,遠(yuǎn)望如同火燒,且發(fā)病面積呈逐年擴(kuò)大的趨勢(shì),截至2015年初,塔城地區(qū)各縣(市)均發(fā)現(xiàn)有楊樹樹皮發(fā)黑情況。塔城地區(qū)林科所先對(duì)塔城盆地防護(hù)林進(jìn)行了調(diào)查,調(diào)查結(jié)果顯示塔城地區(qū)所有俄羅斯楊樹林地均不同程度感病,發(fā)病面積達(dá)2×104hm2,對(duì)塔城地區(qū)生態(tài)建設(shè)帶來毀滅性的災(zāi)害。
本文在研究俄羅斯楊該枝干病害進(jìn)行病原菌分離時(shí)分離獲得一株鏈格孢屬真菌。鏈格孢屬(Alternaria)真菌是全球分布最廣,經(jīng)濟(jì)上重要的半知菌類真菌之一[3]。95%以上的種類兼性寄生于植物上,引起多種植物病害,能廣泛引起農(nóng)作物的多種病害及果蔬貯藏期間的腐爛變質(zhì),造成全球性的田間和產(chǎn)后巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。因其可能為潛在的病原菌,筆者對(duì)該菌種進(jìn)行了形態(tài)和ITS鑒定,并對(duì)該菌進(jìn)行了常用的殺菌劑敏感性測(cè)定,以期為以后防治該鏈格孢屬真菌引起的病害提供數(shù)據(jù)支撐。
病害樣本采集自新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)。塔城地區(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)西北部,地處82°16′-87°21′E、43°25′-47°15′N之間。塔城地區(qū)屬干旱半干旱大陸性氣候,多風(fēng)少雨,冷暖波動(dòng)大,年平均降水量142-295mm,年平均氣溫5-7℃,年極端最高溫40℃,極端最低溫-40℃,地方性小區(qū)氣候比較明顯。全區(qū)無霜期一般為150-180d,年均日照時(shí)數(shù)2 832.0-3 006.0h[5]。
供試病害樣本為5年生俄羅斯楊樹干。
化學(xué)農(nóng)藥 80%代森錳鋅可濕性粉劑(陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司)、10%多抗霉素可濕性粉劑(績溪農(nóng)華生物科技有限公司)、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇省江陰市農(nóng)藥二廠有限公司)、65%代森鋅可濕性粉劑(河北青園農(nóng)藥有限公司)和50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省無錫市錫南農(nóng)藥有限公司)。
生化試劑 TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;TaqDNA Polymerase購自Thermo公司;引物采用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3’),由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。
培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g,pH自然,121℃,0.1MPa高壓滅菌20min,備用。
1.3.1 菌種分離與培養(yǎng)
采用組織分離法進(jìn)行菌種分離[6-7],取滅菌培養(yǎng)皿1個(gè),加入25%乳酸1-2滴,將熔化冷至45℃左右的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,輕輕搖動(dòng)使成平面。選擇新鮮樹皮組織用剪刀或解剖刀切取邊長約3-5mm病組織數(shù)塊,在70%酒精中浸10s,移入0.1%升汞液中消毒1-3min,滅菌水中連續(xù)漂洗3次。將病組織小塊移至培養(yǎng)基平面上,每培養(yǎng)皿內(nèi)可放2-3塊,置于26-28℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng),3-4d后觀察結(jié)果。
1.3.2 菌種形態(tài)鑒定
采用玻片培養(yǎng)法,對(duì)分離的菌種進(jìn)行菌絲和孢子形態(tài)觀察。將分離獲得的純種菌絲標(biāo)記為HP,用直徑為6mm的打孔器打取菌絲圓片,接種在培養(yǎng)皿中心位置,將處理好的無菌的蓋玻片斜插到平板中約呈45°,每皿插入2片,待菌絲長到蓋玻片中央時(shí),用鑷子輕輕將蓋玻片抽出,蓋玻片中有菌絲的一面朝上,用OLYMPUS BX 51顯微鏡鏡檢,拍照。
1.3.3 菌種ITS-PCR鑒定
(1)菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測(cè) 分離得到的菌種HP接種到PDA平板培養(yǎng)基中,25℃下靜置培養(yǎng)7d后,刮取菌落邊緣的新鮮菌絲,使用TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒及相關(guān)方法進(jìn)行基因組DNA提取,具體操作方法按說明書進(jìn)行,提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。?μL提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用Syngene G:BOX凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。
(2)ITS-PCR及序列分析 以基因組DNA為模板,應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,ITS-PCR擴(kuò)增體系為:10PCR Buffer 2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,引物(10mmol/L)0.5μL,rTaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL,模板DNA 1μL,用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,終止溫度在4℃。反應(yīng)結(jié)束后取6μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳結(jié)果,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)構(gòu)登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行BLAST比對(duì)。
采用生長速率抑制法[8]測(cè)定藥劑對(duì)菌株的抑制效果,制備含不同稀釋倍數(shù)藥劑的PDA平板,用直徑為6mm的打孔器打取培養(yǎng)好的菌絲餅接種至含藥平板的中央,置于25℃進(jìn)行培養(yǎng),待對(duì)照長滿整個(gè)平皿時(shí)結(jié)束培養(yǎng),每個(gè)濃度處理重復(fù)3次,以無藥劑處理作為對(duì)照。藥劑濃度設(shè)置為,80%代森錳鋅可濕性粉劑:400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、800倍液、900倍液、1 000倍液、1 200倍液、1 600倍液;10%多抗霉素可濕性粉劑:800倍液、1 000倍液、1 200倍液、1 400倍液、1 600倍液、1 800倍液、2 100倍液、2 500倍液、3 200倍液;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑:700倍液、800倍液、900倍液、1 000倍液、1 100倍液、1 200倍液、1 300倍液、1 500倍液、1 700倍液;65%代森鋅可濕性粉劑:200倍液、300倍液、400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、900倍液、1 200倍液、1 800倍液;50%多菌靈可濕性粉劑:200倍液、300倍液、400倍液、500倍液、600倍液、700倍液、900倍液、1 200倍液、1 800倍液。
培養(yǎng)結(jié)束后利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,并計(jì)算相對(duì)抑菌率[4]。
相對(duì)抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)÷(對(duì)照菌落直徑-0.6)×100%。
將抑菌率轉(zhuǎn)換成抑菌機(jī)率值(y),殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值(x)根據(jù)殺菌劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與抑菌機(jī)率值,得出不同殺菌劑對(duì)供試菌株的毒力回歸方程y=ax+b,數(shù)據(jù)整理應(yīng)用Excel軟件,毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析獲得。
經(jīng)過組織分離及兩次純化獲得了純種菌絲HP,HP在PDA上的菌落特征表現(xiàn)為:25℃培養(yǎng)7d左右菌落直徑可達(dá)7-9cm,生長速度快,菌落平展,絨毛狀,厚實(shí),菌落邊緣整齊,初時(shí)菌落灰白色,后顏色變?yōu)樯钌?灰綠色),可產(chǎn)生色素,背面藍(lán)黑色至黑色,有同心輪紋,見圖1。
圖1 HP菌種分離及菌落特征
經(jīng)OLYMPUS BX 51顯微鏡檢,HP菌絲單生或有分枝,有隔,有索狀聯(lián)合。分生孢子梗直立或彎曲,分生孢子黃褐色,倒棒狀、倒梨形或橢圓形,臍部明顯。具有若干橫、縱隔膜,分隔處平滑或縊縮,根據(jù)《真菌分類學(xué)》[9]初步判斷為鏈格孢屬真菌,見圖2。
圖2 HP菌絲和孢子顯微形態(tài)
提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖3),DNA條帶清晰、較明亮,可以作為PCR反應(yīng)的模板。以DNA為模板,ITS1、ITS4為引物對(duì)rDNAITS區(qū)段PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示片段大小約為600bp(圖4)。
圖3 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖
rDNA ITS區(qū)段序列測(cè)定結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為540bp(圖4)。測(cè)序結(jié)果登錄NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn搜索,序列與登錄號(hào)KP900243.1(Alternariaalternata)、KJ173524.1(Alternariaalternate)的菌種覆蓋度(Query cover)達(dá)100%,相似性(Ident)達(dá)99%,結(jié)合菌種的形態(tài)確定該菌為Alternariaalternate(鏈格孢菌)。鏈格孢菌屬于半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科、鏈格孢屬(Alternaria)。
5種殺菌劑室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果見表1。由表1可以看出,5種藥劑隨著藥劑處理濃度的增加對(duì)HP的抑制率均相應(yīng)地提高。其中多抗霉素抑菌率為70.42%-100%,在800-1 200倍液可完全抑制鏈格孢菌的生長,抑菌率達(dá)100%,致死中濃度EC50=0.035 1mg/mL;代森錳鋅抑菌率在70.36%-90.68%,致死中濃度EC50=0.280 5mg/mL;代森鋅抑菌率在46%-85%,致死中濃度EC50=0.502 2mg/mL;甲基硫菌靈和多菌靈抑菌率不高,基本在20%-30%左右;致死中濃度EC50分別為3.751 9mg/mL和11.008 5mg/mL。
圖4 rDNA ITS擴(kuò)增電泳圖
鏈格孢屬真菌是以細(xì)鏈格孢A.tenuissima為模式種建立起來的真菌屬[11]。該屬形態(tài)特征鮮明,易于辨認(rèn),但在不同的培養(yǎng)條件下,其分生孢子大小、隔膜、形狀和顏色等種間變異性大,造成種級(jí)分類鑒定困難[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,核糖體(rDNA)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間(ITS)、延伸因子1-α(TEF1或EF1-α)、肌動(dòng)蛋白(ACT)等在鏈格孢菌鑒定中廣泛應(yīng)用[12]。ITS(Internal transcribed spacer)是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),其保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致,種間高度特異[10],ITS序列通過與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索比對(duì),序列相似性99%,可以鑒別為相同種;序列相似性為95%-99%,可以鑒別為相同屬[13]。本研究通過分離菌種的形態(tài)特征結(jié)合ITS序列鑒定,確定從俄羅斯楊上分離的菌種為鏈格孢菌。
表1 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果
鏈格孢菌可以引起楊樹葉枯病[14]、棗果黑斑病[12]、核桃枯葉病[15]、鐵皮石斛枯梢病[16]及多種農(nóng)作物病害,作為潛在的致病菌,有必要進(jìn)行藥劑篩選試驗(yàn)。本研究通過5種藥劑對(duì)HP菌絲抑菌性試驗(yàn),結(jié)果表明:10%多抗霉素對(duì)供試菌株毒力最強(qiáng),致死中濃度(EC50)值為0.035 1mg/mL,其他依次為80%代森錳鋅、65%代森鋅、50%多菌靈和70%甲基硫菌靈,可以將10%多抗霉素作為防治HP的首選藥劑。