董春燕

(青州市亞泰農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 青州 262500)

鎘(Cd)是植物非必需的重金屬元素，具有移動性強和生物毒性大的特點，易被植物吸收[1]，并對植物的生長發(fā)育造成不利影響，如降低葉片光合性能、抑制植物代謝進程、改變植物體內(nèi)酶的催化功能和破壞活性氧的代謝平衡，進而引起植株早衰甚至死亡[2]。近年來，隨著工礦業(yè)的迅猛發(fā)展及各類化學藥品的廣泛施用，土壤鎘污染程度加劇，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類的身體健康帶來嚴重危害，從而引起了社會各界的廣泛關(guān)注。當前，有關(guān)鎘脅迫在長春花[Catharanthusroseus(L.)G. Don][3]、圓葉決明[Chamaecristarotundifolia(Pers.)Greene][4]、紫蘇[Perillafrutescens(L.)Britt.][5]、車軸草(TrifoliumLinn.)[6]等作物上已有眾多研究報道，而在三葉草上研究主要集中在鎘在三葉草體內(nèi)的富集特性[7]，而有關(guān)鎘對三葉草種子萌發(fā)、幼苗生長及保護酶活性等方面的研究未見報道。本試驗采用水培試驗,研究了鎘單一脅迫對三葉草(TrifoliumpretenseL.)種子萌發(fā)、幼苗生長、光合色素含量及保護酶系統(tǒng)的影響,旨在探明三葉草對鎘的忍受范圍，并探尋鎘對三葉草的毒害機理，以期為三葉草鎘脅迫機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

三葉草種子由山東農(nóng)業(yè)工程學院實驗基地提供。在濟南工程學院試驗基地采集同一繁殖系內(nèi)形態(tài)指標基本一致、無病蟲害的三葉草幼苗。

1.2 方法

1.2.1 三葉草種子萌發(fā)試驗

通過在1/2Hoagland溶液中添加Cd(NO3)2配制成鎘濃度分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的溶液。選擇飽滿的三葉草種子，用0.1%的升汞進行表面消毒4min，蒸餾水反復沖洗后均勻播種到鋪有2層消毒紗布的培養(yǎng)皿中，每皿50粒。用鎘濃度分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的1/2Hoagland溶液浸種，每天更換1次1/2Hoagland溶液，每處理3次重復。浸種后放置于溫度22-25℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄每天的發(fā)芽情況，處理第7d開始計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，測定苗長、芽長、根長和胚軸長，取平均值。

1.2.2 三葉草水培試驗

用自來水沖洗掉葉片及根系上的泥土，移栽到裝有1/2Hoagland溶液的塑料箱中，每箱栽植10株，培養(yǎng)5d后，將其溶液更換成含有鎘濃度分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的1/2Hoagland溶液，每處理3次重復，即每處理栽植3個塑料箱的三葉草，每4d更換1次培養(yǎng)液，鎘脅迫14d后對三葉草幼苗苗長、芽長、胚軸長、根長、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)進行測定。

1.2.3 測定指標

用游標卡尺測定苗長、芽長、胚軸長和根長。采用分光光度法測定光合色素含量[8]；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性分別采用氮藍四唑(NBT)還原法、高錳酸鉀滴定法和愈創(chuàng)木酚法進行測定[9]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性檢測參照Nakano和Asada的方法[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

發(fā)芽率(%)=種子發(fā)芽粒數(shù)/種子播種粒數(shù)×100；發(fā)芽勢(%)=前3d發(fā)芽種子總數(shù)/皿中供試種子數(shù)×100；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt(Gt為t時間種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù));活力指數(shù)(VI)=GI×S(S為苗長)。

使用Microsoft Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)圖表進行處理，使用DPS 7.02軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對三葉草種子萌發(fā)的影響

由表1可知，不同濃度的鎘脅迫對三葉草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響顯著。隨營養(yǎng)液中鎘濃度的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，在鎘濃度0.5mmol/L時，上述指標較對照0mmol/L分別降低9.52%、55.00%、17.17%和54.12%；而當在鎘濃度3.5mmol/L時，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)較對照降低92.75%和93.34%，發(fā)芽勢和活力指數(shù)為0，差異極顯著(P<0.01)。由此可見，鎘對三葉草種子萌發(fā)的抑制程度與其濃度具有正相關(guān)關(guān)系，至3.5mmol/L時能夠完全抑制其萌發(fā)。

表1 不同濃度鎘脅迫對三葉草種子萌發(fā)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫或大寫字母表示5%或1%顯著水平，下同。

2.2 鎘脅迫對三葉草幼苗生長的影響

由表2可以看出，不同濃度的鎘對三葉草幼苗的生長均具有抑制作用，抑制程度隨其濃度增加而增加。隨鎘濃度的增加，三葉草幼苗苗長、芽長、胚軸長和根長逐漸減小，且各處理間差異均達到極顯著水平(P<0.01)，在鎘濃度0.5mmol/L、1.5mmol/L和2.5mmol/L時上述指標與對照的比值分別為0.55、0.16、0.059，0.70、0.18、0.07，0.71、0.17、0.072，0.36、0.13、0.04，可見鎘對三葉草幼苗根的伸長抑制作用最強，苗長次之，芽長和胚軸長相對較小。在鎘濃度3.5mmol/L時，苗長、芽長、胚軸長和根長均為0，表明在該濃度下三葉草幼苗生長被完全抑制。

表2 不同濃度鎘脅迫對三葉草幼苗生長的影響

2.3 鎘脅迫對三葉草幼苗光合色素含量的影響

由圖1可知，鎘脅迫能夠降低三葉草光合色素含量，且隨鎘濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)和類胡籮卜素均隨鎘濃度(0-3.5mmol/L)的增加表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，即隨鎘脅迫強度的增加而顯著減小。在0.5mmol/L時上述指標較對照分別降低41.14%、24.32%、37.64%和21.05%，而當鎘3.5mmol/L時上述指標較對照分別降低94.40%、70.27%、89.32%和77.37%，與對照差異達到極顯著水平(P<0.01)，表明在該濃度下三葉草葉綠體的結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞。

圖1不同濃度鎘脅迫對三葉草幼苗光合色素含量的影響

注：同一柱形圖不同小寫或大寫字母表示5%或1%顯著水平，下同

Fig.1 Effect of stress on photosynthetic pigments inTrifoliumpretenseL.seedlings

2.4 鎘脅迫對三葉草葉片保護酶系統(tǒng)的影響

由圖2可知，三葉草葉片的SOD、CAT和POD活性在鎘脅迫下其變化趨勢相同，均隨Cd濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在鎘濃度1.5mmol/L時SOD、CAT和POD活性達到最大，極顯著高于其他處理(P<0.01),較對照分別增加36.02%、33.53%和93.55%；當鎘濃度繼續(xù)增加，上述指標開始下降，至鎘濃度為3.5mmol/L時SOD、CAT活性均低于對照，但二者差異不顯著，而POD仍高于對照，且與對照差異亦不顯著；這表明在鎘濃度0-1.5mmol/L范圍內(nèi)，鎘濃度的增大能誘導葉片SOD、CAT和POD活性的提高。APX活性在鎘濃度0.5mmol/L時最高，較對照提高80.80%，當鎘濃度1.5mmol/L時開始降低，但其活性仍高于對照，當鎘濃度至3.5mmol/L時開始低于對照，較對照降低19.44%，差異極顯著(P<0.01)。

圖2 不同濃度鎘脅迫對三葉草葉片保護酶系統(tǒng)的影響

3 結(jié)論與討論

采用水培試驗，研究不同濃度的鎘脅迫對三葉草種子萌發(fā)、幼苗生長、光合色素含量及保護酶系統(tǒng)的影響，以探究三葉草對鎘脅迫的敏感性和耐性，對探討三葉草鎘脅迫機制、指導鎘脅迫地區(qū)的景觀綠化設計有重要意義。結(jié)果表明：鎘能夠抑制三葉草種子萌發(fā)和幼苗生長，在鎘濃度0.5mmol/L時其種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長、芽長、胚軸長和根長被抑制，較對照差異達極顯著水平(P<0.01)，鎘濃度至3.5mmol/L時發(fā)芽勢、活力指數(shù)和幼苗生長被完全抑制。葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素隨鎘濃度的增加而降低，與對照對照差異極顯著(P<0.01)。在鎘濃度 0-1.5mmol/L范圍內(nèi)，保護酶SOD、CAT和POD活性升高，較對照分別提高36.02%、33.53%和93.55%，繼續(xù)增加鎘濃度至2.5mmol/L時酶活性呈下降趨勢；APX活性在鎘濃度為0.5mmol/L時最高，較對照提高80.80%，繼續(xù)增加鎘濃度其活性開始下降，表明在低濃度鎘(0-0.5mmol/L)脅迫下，三葉草幼苗具有較強的抗氧化能力。

種子萌發(fā)與幼苗生長狀況對作物后期的生長和生物量的積累有直接影響。鎘雖然是植物生長過程的非必需元素，但鎘脅迫會對種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生不同程度的影響。一般認為，鎘在低濃度條件下對種子萌發(fā)及幼苗生長有積極的刺激作用，而在高濃度條件下產(chǎn)生抑制效應[11]。王新新等[12]研究指出，低濃度的鎘對堿蓬[Suaedaglauca(Bunge)Bunge.]種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼莖長度和幼莖重量有誘導作用，而高濃度時表現(xiàn)出抑制的特性。王興明等在進行鎘脅迫對油菜(BrassicanapusL.)種子萌發(fā)試驗研究時也得出類似的結(jié)論，即鎘脅迫對油菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)具有低濃度促進高濃度抑制的特性[13]。本試驗條件下,當鎘濃度達到0.5mmol/L時對三葉草種子萌發(fā)和幼苗生長均產(chǎn)生抑制作用，且隨著其濃度增加抑制作用增強,表明三葉草對鎘較為敏感,這與前人研究結(jié)論不盡相同。究其原因,這可能與本試驗鎘濃度設置較高有關(guān)，也可能是不同作物對鎘的生理響應存在差異而致，具體原因?qū)⒃诤罄m(xù)試驗中進一步探究。鎘對三葉草種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生抑制的原因可能是其在高濃度條件下能夠?qū)ΨN子的胚和芽等產(chǎn)生傷害，同時抑制種子內(nèi)淀粉酶和蛋白酶的活性，進而制約了種子內(nèi)淀粉與蛋白質(zhì)的分解，使種子在萌發(fā)時得不到充足的養(yǎng)分供應，最終限制了種子的萌發(fā)[14]。

光合色素可作為判斷植物光合性能強弱和反映逆境脅迫狀況的重要指標之一。葉綠素作為綠色植物主要的光合色素，其含量高低不僅可以在一定程度上反映植株光合能力的強弱，還可以表征在逆境脅迫條件下植物組織和器官的損害程度及衰老狀況[15]。吳坤等[16]研究認為，葉綠素和類胡蘿卜素含量隨鎘脅迫濃度具有負相關(guān)關(guān)系。段瑞軍等[17]研究認為，鎘濃度低于50mg/kg時對海雀稗(Paspalumvaginatum)葉綠素含量的影響不顯著，當鎘濃度高于100mg/kg時葉綠素含量顯著降低。本試驗結(jié)果表明，隨著鎘濃度的增加三葉草光合色素含量顯著降低，與前人研究結(jié)論類似，這可能是因為鎘脅迫刺激了植株體內(nèi)脫落酸(ABA)合成的增加，而ABA能夠反向調(diào)節(jié)葉綠素a和葉綠素b結(jié)合蛋白基因，抑制葉綠素的合成[18]，另外，鎘在植株體內(nèi)的積累能夠使葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，限制了葉綠素的合成[19]。鎘可以誘導植物體活性氧(O2·-和H2O2)的產(chǎn)生和清除失去平衡，引起活性氧的積累，活性氧啟動膜脂過氧化使膜結(jié)構(gòu)遭受破壞，細胞功能失常，機體出現(xiàn)各種自由基綜合癥[20]。SOD、CAT、POD和APX是植物體保護酶系統(tǒng)中清除活性氧的重要酶類[21]。當植物遭受重金屬脅迫時保護酶活性開始升高以清除逆境條件下產(chǎn)生的活性氧[22]，因此保護酶活性高低可用于檢驗環(huán)境中是否存在活性氧誘因，同時也是植物體在活性氧誘導下啟動自身防御機制的正常反應[23]。高芳等[24]研究指出，隨鎘濃度的升高豫花15號葉片SOD和POD活性表現(xiàn)為先升高后降低，而CAT表現(xiàn)為先降低后升高再降低的變化趨勢，但其總的趨勢是下降。Wang X M等[25]研究認為，在鎘處理下油菜POD和CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢，且POD活性對鎘脅迫較SOD和CAT敏感?？梢姡Ｗo酶在不同植物上的表現(xiàn)存在差異。本試驗結(jié)果表明，在鎘濃度0-1.5mmol/L范圍內(nèi)，三葉草葉片的SOD、CAT和POD活性上升，繼續(xù)增加Cd濃度其活性下降，這可能是因為在低濃度的鎘脅迫條件下，三葉草葉片SOD、CAT和POD活性隨體內(nèi)活性氧的增多應激性升高，三者協(xié)同作用清除自由基和過氧化物，防止自由基對植物機體的毒害，而當重金屬鎘濃度較高時活性氧進一步增多，超出了保護酶抗氧化能力范圍，酶蛋白受到損傷，酶的生物合成調(diào)節(jié)系統(tǒng)也遭受破壞，酶的活性降低，這與Dinakar N等[26]在鎘對落花生(ArachishypogaeaLinn.)幼苗保護酶活性影響上的研究結(jié)果相一致。APX活性在鎘濃度0.5mmol/L時最高，繼續(xù)增加鎘濃度其活性呈下降趨勢，這可能是因為APX以抗壞血酸(ASA)作反應底物，其活性與ASA濃度正相關(guān)，在高濃度鎘脅迫下ASA濃度減小致使APX活性隨之降低[27]。