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(佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

葡萄酒都含有酸味物質(zhì)，其對(duì)于葡萄酒的口感、穩(wěn)定性和陳釀特性具有重要作用。適量的酸味物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒爽利、清新等口感的要素[1]。酸度過(guò)低，酒體則會(huì)平淡乏味；酸度過(guò)高，酒體口感生硬粗澀。葡萄酒中的有機(jī)酸種類繁多，主要包括酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸，其中對(duì)口味影響最大的是L-蘋(píng)果酸。而降酸酵母菌可以通過(guò)蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵，使葡萄酒中的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，降低蘋(píng)果酸濃度，改善葡萄酒的口味[2]。降酸酵母菌Yds-10是從東北山葡萄酒中篩選出的具有一定降酸能力的酵母菌，為了獲得更多的培養(yǎng)物，研究對(duì)其最佳培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和優(yōu)化，旨在為降酸酵母菌Yds-10的應(yīng)用培養(yǎng)探究最佳培養(yǎng)基配方。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)用菌

降酸酵母菌Yds-10：學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室篩選保存高降酸能力酵母菌。

1.1.2 儀 器

高溫滅菌器，恒溫培養(yǎng)箱，低速臺(tái)式離心機(jī)TDZ4-WS，分光光度計(jì)等。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)活化培養(yǎng)基[3](g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉5，于0.1MPa滅菌20 min。

(2)山葡萄汁培養(yǎng)基(g/L)：在滅菌活化培養(yǎng)基中加滅菌山葡萄汁50mL。

(3)麥芽汁培養(yǎng)基(g/L)：在活化培養(yǎng)基中加濃度為12%的麥芽汁50mL。

(4)馬鈴薯培養(yǎng)基[4](g/L)：在活化培養(yǎng)基中加20%馬鈴薯浸汁50mL。

(5)YPD培養(yǎng)基[3](g/L)：大豆蛋白胨4，胰蛋白胨4，酵母浸粉3，葡萄糖20于0.1MPa滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 山葡萄汁的制備及滅菌

(1) 果汁的制備 取無(wú)霉壞的山葡萄，去梗，清洗，破碎，用紗布過(guò)濾，倒入離心管中，于2500r/min離心10min，取上清液備用。

(2) 果汁滅菌 將裝有果汁帶蓋的試管置于90℃恒溫水浴鍋，保溫30min，取出自然冷卻至室溫；重復(fù)3次，取上清液備用。

1.2.2 菌種活化與接種

(1) 菌種活化 將降酸酵母菌Yds-10接種至活化培養(yǎng)基中，于28℃恒溫箱培養(yǎng)24h進(jìn)行活化，取出備用。

(2) 接種 取活化后菌懸液于離心管中，3000r/min離心10min，棄去上清液，將沉淀的菌接種于滅菌的培養(yǎng)基，接種量10%。

1.2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

按1.2.2接種方法將降酸酵母菌Yds-10分別接種于活化培養(yǎng)基、葡萄汁培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中，測(cè)28℃下培養(yǎng)24 h和48 h降酸酵母菌Yds-10的生長(zhǎng)量，每種培養(yǎng)基重復(fù)培養(yǎng)三份，結(jié)果取平均值。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

不改變YPD培養(yǎng)基中其它成分的用量，分別對(duì)葡萄糖(10、20、30、40、50)g/L、蛋白胨(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L、胰蛋白胨(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L及酵母浸粉(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L的添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。測(cè)28℃下培養(yǎng)24 h和48 h培養(yǎng)液降酸酵母菌Yds-10的生長(zhǎng)量，重復(fù)培養(yǎng)每種培養(yǎng)基各三份，取其平均值。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)YPD培養(yǎng)基成分葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)L9(34)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.6 檢測(cè)方法

菌體生長(zhǎng)量測(cè)定[5]：采用測(cè)定光密度值的方法。 將培養(yǎng)液從培養(yǎng)箱中取出，搖晃均勻后立即倒入帶刻度、滅菌、干燥的離心管中，每個(gè)離心管倒入5mL培養(yǎng)基懸浮液，于3000r/mim離心10min后，棄去上清液，用無(wú)菌水定容至10mL，搖均，倒入比色管中，以無(wú)菌水做空白對(duì)照，立刻放入可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)600nm下測(cè)定其的光密度值(OD600)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

測(cè)降酸酵母菌Yds-10在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、山葡萄培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量光密度值OD600，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

分析表2，在接種量相同，培養(yǎng)時(shí)間相同的情況下，比較降酸酵母菌Yds-10在五種培養(yǎng)基中培養(yǎng)中培養(yǎng)24h和48h培養(yǎng)的生長(zhǎng)量及三次測(cè)量結(jié)果的平均值，YPD培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量OD600值最高，高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、山葡萄培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基四種培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基生長(zhǎng)量OD600值培養(yǎng)24h和48h的測(cè)量結(jié)果的平均值為1.035，比活化培養(yǎng)基高出0.322，故選擇YPD培養(yǎng)基作為降酸酵母菌Yds-10初篩基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 葡萄糖加量

在保持YPD培養(yǎng)基其它成分不變的情況下，對(duì)YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)培養(yǎng)24 h和48h培養(yǎng)液的OD600值，并計(jì)算兩個(gè)時(shí)間段測(cè)量結(jié)果的平均值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖單因素試驗(yàn)結(jié)果(OD600值)

由圖1得出，不同葡萄糖加量的五個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)降酸酵母菌Yds-1024h和48h培養(yǎng)液的平均OD600值分別為0.886、0.946、1.053、1.054、1.059，隨著葡萄糖加量增加，培養(yǎng)液平均OD600值逐漸增大，但后三組之間差異不大、增大的不明顯。即葡萄糖加量小于30g/L時(shí)，隨著葡萄糖加量增加培養(yǎng)液OD600值增大顯著；葡萄糖加量大于30g/L時(shí)，隨著葡萄糖加量增加培養(yǎng)液OD600值增大不顯著；故葡萄糖加量取30g/L即可。

2.2.2 酵母浸粉加量

保持YPD培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，對(duì)YPD培養(yǎng)基中的酵母浸粉進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)培養(yǎng)24 h和48h培養(yǎng)液的OD600值，并計(jì)算兩個(gè)時(shí)間段測(cè)量結(jié)果的平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酵母浸粉單因素試驗(yàn)結(jié)果(OD600值)

由圖2得出，不同酵母浸粉加量的五個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培養(yǎng)液的平均OD600值分別為0.741、1.016、0.911、0.802、0.812，五種培養(yǎng)液的OD600值差異較明顯；酵母浸粉加量為2.0g/L時(shí)，培養(yǎng)液OD600值最大；故酵母浸粉加量取2.0g/L較適宜降酸酵母菌Yds-10的生長(zhǎng)。

2.2.3 蛋白胨加量

在保持YPD培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，對(duì)YPD培養(yǎng)基中的蛋白胨進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)培養(yǎng)24 h和48h培養(yǎng)液的OD600值，并計(jì)算兩個(gè)時(shí)間段測(cè)量結(jié)果的平均值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白胨單因素試驗(yàn)結(jié)果(OD600值)

由圖3可知，不同蛋白胨加量的五個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培養(yǎng)液的平均OD600值分別為0.672、1.072、1.002、0.887、0.812，隨著蛋白胨加量增加，培養(yǎng)液平均OD600值呈正態(tài)分布，并且五組之間有較明顯差異；蛋白胨加量為2.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)液OD600值最大；故蛋白胨加量取2.0 g/L較適宜降酸酵母菌Yds-10生長(zhǎng)。

2.2.4 胰蛋白胨加量

在保持YPD培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，對(duì)YPD培養(yǎng)基中的胰蛋白胨進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)培養(yǎng)24 h和48h培養(yǎng)液的OD600值，并計(jì)算兩個(gè)時(shí)間段測(cè)量結(jié)果的平均值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 胰蛋白胨單因素試驗(yàn)結(jié)果(OD600值)

由圖4得出，胰蛋白胨加量不同的五個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培養(yǎng)液的平均OD600值分別為1.011、1.014、0.905、0.887、0.812，胰蛋白胨加量為2.0 g/L，培養(yǎng)液平均OD600值最大；之后三組隨著胰蛋白胨加量增加；培養(yǎng)液OD600值逐漸減?。还室鹊鞍纂思恿繛?.0 g/L較適宜降酸酵母菌Yds-10生長(zhǎng)。

2.3 正交試驗(yàn)

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，測(cè)28℃培養(yǎng)24h培養(yǎng)液的OD600值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 L9(34)正交結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)表3極差R分析可得，RA>RB>RC>RD，葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨四個(gè)因素對(duì)降酸酵母菌Yds-10的影響主次依次為：葡萄糖 > 酵母浸粉> 蛋白胨 > 胰蛋白胨；A因素列：K2>K3>K1，B因素列：K2>K1>K3，C因素列：K2>K3>K1，D因素列：K1>K3>K2，因此，培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)組合為A2B2C2D1，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果表3直接觀查可得：試驗(yàn)組4(A2B1C2D3)數(shù)據(jù)最好。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)基配方組合A2B2C2D1和培養(yǎng)基配方組合A2B1C2D3進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)，并以YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果為對(duì)照，測(cè)培養(yǎng)24 h和48 h培養(yǎng)液的生長(zhǎng)量OD600值，結(jié)果見(jiàn)表4.

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

分析表4可得，培養(yǎng)24 h和48h培養(yǎng)液的生長(zhǎng)量OD600值及兩個(gè)時(shí)間段測(cè)得的生長(zhǎng)量OD600值的平均值，均為試驗(yàn)組A2B2C2D1好于試驗(yàn)組A2B1C2D3好于 試驗(yàn)組YPD，試驗(yàn)組A2B2C2D1培養(yǎng)液的OD600值的平均值比YPD試驗(yàn)組高0.041。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基配方的最佳組合為A2B2C2D1，即葡萄糖30g/L、酵母浸粉2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胰蛋白胨0g/L。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)降酸酵母菌Yds-10最佳培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化可知，培養(yǎng)基的成分及填加量對(duì)降酸酵母菌Yds-10的生長(zhǎng)有影響。葡萄糖對(duì)其影響較大，其次是酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨；葡萄糖加量并不是越多越好，單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)均顯示葡萄糖加量為30g/L好于10g/L、20g/L、40g/L、50g/L；蛋白胨、胰蛋白胨的加量，也不是越多越好，在單因素試驗(yàn)中胰蛋白胨加量0g/L時(shí)，降酸酵母菌Yds-10的生長(zhǎng)量與2.0g/L加量差別不明顯，并且隨著加量增多生長(zhǎng)量明顯下降，正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，最終優(yōu)化培養(yǎng)基胰蛋白胨加量0g/L；蛋白胨加量在單因素試驗(yàn)中2.0g/L明顯好于0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L，正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)一致，最好為2.0g/L。通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)以及驗(yàn)證性試驗(yàn)得降酸酵母菌Yds-10最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30g/L、酵母浸粉2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胰蛋白胨0g/L。此培養(yǎng)基培養(yǎng)降酸酵母菌Yds-10，其培養(yǎng)液的OD600值比YPD培養(yǎng)基高4.1%。