, 楠, ， , , , 錦蓮, 武梅*

(佳木斯大學(xué)a.附屬第一醫(yī)院;b藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154002)

0 引 言

細(xì)胞電化學(xué)是基于電化學(xué)原理結(jié)合細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究細(xì)胞荷電粒子能量傳遞的運動規(guī)律，進(jìn)而揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和外源分子對細(xì)胞功能影響的一個新的研究領(lǐng)域。細(xì)胞電化學(xué)在細(xì)胞水平上深入認(rèn)識生命體系的運動規(guī)律，并為揭示生命過程提供科學(xué)依據(jù)和研究方法，為疾病的診治，抗癌，抗衰老藥物的設(shè)計，藥物副作用的控制，食品、醫(yī)療、發(fā)酵、環(huán)保等微生物檢測或監(jiān)控，農(nóng)作物的生長，動物的快速繁殖提供科學(xué)實驗依據(jù)[1]。

葡萄糖是生物體內(nèi)重要的能量來源，其水平過低會引起細(xì)胞損傷，細(xì)胞損傷可導(dǎo)致多種物質(zhì)合成及分解代謝異常，目前常用的細(xì)胞活性檢測方法有很多種，如MTT法、流式細(xì)胞儀法、ATP含量測定法、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法等。電化學(xué)具有簡單、快速、靈敏和價廉等優(yōu)點，近年來在細(xì)胞分析領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。本研究采用電化學(xué)方法，以鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12細(xì)胞)為模型，研究低糖對PC12細(xì)胞的影響。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)分析儀CHI660D(上海辰華儀器有限公司)；PC12 細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；優(yōu)級胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和雙抗購于 Gibco 公司；多壁碳納米管(MWNTs)購于深圳納米港有限公司；離子液體(bmim-PF6)購于百靈威科技有限公司。所用水均為三次蒸餾水，所有試劑均為分析純。

1.2 PC12 細(xì)胞的培養(yǎng)、收集及處理

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：在細(xì)胞間內(nèi)，將8.4 g的1640培養(yǎng)基粉末(無糖)，2g的NaHCO3放在1L的無菌燒杯中，加入適量的無菌三蒸水，使其完全溶解后，轉(zhuǎn)移到1L的無菌容量瓶中，繼續(xù)加無菌三蒸水定容，充分混勻，用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，0.22 μm濾膜在細(xì)胞間超凈臺中進(jìn)行過濾、分裝、蠟封，4℃冰箱中保存。

無糖完全培養(yǎng)基：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入胎牛血清、特級馬血清、谷氨酰胺(4 mmol/L)、非必需氨基酸(10 mmol/L, 100×)、青霉素和鏈霉素(100×)，使其體積比分別為10%、5%、1%、1% 和1%，充分混合后，0.22 μm濾膜過濾，蠟封，4℃冰箱中保存。完全培養(yǎng)基一般情況一次配制100 mL放置于培養(yǎng)瓶中，每次使用前，先將其恢復(fù)至室溫。

0.2mg/ml葡萄糖完全培養(yǎng)基、4.5mg/mL葡萄糖完全培養(yǎng)基、：在上述配制無糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，在電子天平上分別準(zhǔn)確稱取200mg、0.45g葡萄糖完全溶解于無糖完全培養(yǎng)基得到相應(yīng)培養(yǎng)基。

PC12 細(xì)胞加適量的 DMEM 培養(yǎng)液，置于 37℃、5% CO2、100% 飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的貼壁高分化 PC12 細(xì)胞取出，除去培養(yǎng)基，用 pH 7.4 的 PBS 緩沖溶液沖洗 3次，然后加入適量 pH 7.4 的 PBS 緩沖溶液，50℃浴裂解30 min，獲得細(xì)胞裂解液，將其用于電化學(xué)和高效液相檢測。

1.3 電化學(xué)檢測

電化學(xué)檢測采用線性掃描伏安法在25 ℃下進(jìn)行；采用三電極檢測系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的檢測，以Pt絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，多壁碳納米管-離子液體復(fù)合修飾的玻碳電極(MWCNT-IL/GCE)為工作電極，制成三電極微反應(yīng)池系統(tǒng)。對細(xì)胞原位裂解后進(jìn)行電化學(xué)檢測，檢測條件：掃速為 100mv·s-1，掃描電位為 0 ～ 1．1V，富集時間為 360s。

2 結(jié)果與討論

2.1 PC 12 細(xì)胞的電化學(xué)行為研究

對PC 12 細(xì)胞的電化學(xué)行為進(jìn)行研究，探尋 PC12細(xì)胞的電化學(xué)信號歸屬。對 PC12細(xì)胞、四種嘌呤和尿酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行定性檢測、匹配比對，圖1為PBS和五種標(biāo)準(zhǔn)品混合物及其PC12細(xì)胞裂解液的線性掃描伏安圖。a線是修飾電極在PBS溶液中的線性掃描伏安曲線，為一平滑曲線，未見任何峰電位；b線是五種混合標(biāo)準(zhǔn)品PBS溶液的線性掃描伏安曲線，在0.69 V處為黃嘌呤和鳥嘌呤的混合電化學(xué)信號，在1.0 V處為腺嘌呤和次黃嘌呤的混合電化學(xué)信號。c線為 PC12細(xì)胞裂解液的的線性掃描伏安曲線，可見在0.28 V處尿酸峰與單線尿酸峰位重合，在0.69 V處為黃嘌呤和鳥嘌呤的混合電化學(xué)信號，在1.0 V處為腺嘌呤和次黃嘌呤的混合電化學(xué)信號不明顯；根據(jù)本課題組已有研究提示，尿酸峰因為細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞數(shù)量的多少峰電位值相差較大，不予以此信號為檢測點，次黃嘌呤和腺嘌呤因為拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，峰位值不穩(wěn)定，不予應(yīng)用，黃嘌呤和鳥嘌呤信號經(jīng)反復(fù)證明是穩(wěn)定可靠的，故實驗以黃嘌呤和鳥嘌呤混合電化學(xué)信號峰為實驗依據(jù)。

圖1 修飾電極對PBS、五種標(biāo)準(zhǔn)品混合物及PC12細(xì)胞裂解液的線性掃描伏安圖

a：PBS(電化學(xué))(PH=7.4) b：五種標(biāo)準(zhǔn)品混合液(濃度：5×10-6mmol/L) c: PC12細(xì)胞裂解液(濃度：2×106 cells/mL)

圖2 PC12細(xì)胞裂解液及其五種混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

2.2 高效液相色譜法檢測五種標(biāo)準(zhǔn)品混合液及PC12細(xì)胞裂解液

圖2為證實PC12細(xì)胞是否含四種嘌呤和尿酸，首先對PC12細(xì)胞進(jìn)行純五種標(biāo)準(zhǔn)品驗證，依次加入五種標(biāo)準(zhǔn)品，歸屬每一標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，然后使用傳統(tǒng)高效液相色譜檢測證明PC12細(xì)胞電化學(xué)的可靠性，PC12 細(xì)胞樣品在檢測前去除大分子蛋白質(zhì)等，取20 μL進(jìn)行檢測，由實驗結(jié)果可示PC12細(xì)胞裂解液的色譜圖顯示5個色譜峰，與五種標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰重合，a線為五種標(biāo)準(zhǔn)品混合液色譜圖，b線為PC12細(xì)胞裂解液色譜圖，五種標(biāo)準(zhǔn)品及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)四種嘌呤和尿酸的保留時間為：10.9 min處為尿酸、12.8 min處為次黃嘌呤、14.3 min處為鳥嘌呤、16.0 min處為黃嘌呤和26.3 min處為腺嘌呤。

2.3 不同葡萄糖濃度作用于PC12細(xì)胞的生長曲線

為了確定葡萄糖濃度對 PC12細(xì)胞活性的影響，將PC12細(xì)胞分為4.5mg/mL葡萄糖陽性對照組、無糖陰性對照組、0.2mg/mL低糖組三組，首先建立細(xì)胞生長曲線持續(xù)跟蹤細(xì)胞生長狀況及觀察細(xì)胞狀態(tài)，并將不同葡萄糖濃度的生長曲線進(jìn)行曲線擬合(圖3)。結(jié)果顯示4.5mg/mL陽性對照組自第三天開始，細(xì)胞生長速度較快，平臺期不明顯，但培養(yǎng)至7d時細(xì)胞生長較之前緩慢；無糖陰性對照組在前4d生長較為緩慢，自第六天開始，呈對數(shù)生長趨勢，且與4.5mg/mL陽性對照組相比細(xì)胞數(shù)較少；0.2mg/mL低糖組與無糖陰性對照組生長趨勢一致，但細(xì)胞數(shù)量較無糖組高，提示過低葡萄糖濃度對細(xì)胞損害較大。

圖3 不同葡萄糖濃度作用于PC12細(xì)胞的生長曲線

2.4 原位電化學(xué)法檢測不同葡萄糖濃度作用于PC12細(xì)胞的電化學(xué)行為

利用原位裂解定體積檢測各組PC12細(xì)胞，由于原位裂解代表整體細(xì)胞活性，不僅包含每個細(xì)胞的電化學(xué)活性，而且還與各組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，故綜合因素后環(huán)境驟變引起的波動現(xiàn)象不明顯，實驗檢測結(jié)果如下(圖4)：各組電化學(xué)細(xì)胞活性曲線均呈S型，逐漸上升達(dá)到細(xì)胞接觸后PC12細(xì)胞活性開始下降。可見4.5mg/mL陽性對照組電化學(xué)信號明顯高于其他組細(xì)胞，0.2mg/mL葡萄糖組細(xì)胞活性次之，無糖陰性對照組電化學(xué)信號最弱，提示低葡萄糖濃度均損害整體的PC12細(xì)胞活性。

圖4 原位電化學(xué)法檢測不同葡萄糖濃度作用于PC12細(xì)胞的電化學(xué)行為變化

a：4.5mg/mL葡萄糖陽性對照組 b: 無糖陰性對照組 c: 0.2mg/mL低葡萄糖組

3 結(jié) 論

以PC12細(xì)胞模擬神經(jīng)細(xì)胞為模型，探討神經(jīng)元細(xì)胞在不同葡萄糖濃度環(huán)境生長狀態(tài)，本次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在無糖和低糖環(huán)境持續(xù)培養(yǎng)中，低糖、無糖不止細(xì)胞數(shù)量較陽性對照組少，且細(xì)胞活性和嘌呤核苷酸的代謝較陽性對照組明顯減弱，進(jìn)一步證明了過低葡萄糖濃度均對神經(jīng)元細(xì)胞活性的損害。上述實驗結(jié)果提示在糖尿病患者中，應(yīng)密切監(jiān)測患者血糖值，保持血糖值的穩(wěn)定性，避免因血糖過低導(dǎo)致大腦神經(jīng)元的損害，特別是罹患急性腦梗死的糖尿病患者，避免缺血再灌注損傷過程中血糖急劇的波動加重大腦神經(jīng)元的損傷。